पुनः संयोजक प्रोटीन फँसाना चाहे का उपयोग फेज प्रदर्शन और आत्मीयता चयन के लिए एक प्रोटोकॉल
Summary
फेज प्रदर्शन ब्याज की एक स्थिर अणु के साथ बातचीत कि प्रोटीन या प्रोटीन moieties कब्जा करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. बनाने के लिए फेज सीडीएनए लाइब्रेरी के प्रकार और स्क्रीन के एक निर्णय लिया गया है, यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल interactors की पहचान करने के लिए अग्रणी कुशल आत्मीयता चयन परमिट.
Abstract
Immobilized चारा अणुओं को एक directionally क्लोन सीडीएनए पुस्तकालय द्वारा इनकोडिंग विभिन्न प्रोटीन अंश पेश करने के लिए एक पाड़ के रूप में पुनः संयोजक फेज का उपयोग कर बातचीत की खोज के लिए एक कारगर साधन है. तकनीक काफी हद तक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया गया है लेकिन चुनौती नहीं दी जा चारा अणु प्रोटीन तक ही सीमित नहीं होना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल फँसाना की एक मामूली संख्या में एक ही प्रोटीन पेश स्वतंत्र क्लोन की पहचान को अधिकतम करने के लिए replicates में जांच की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है. यह पहचान की बातचीत प्रोटीन चारा अणु की वैध interactors हैं कि अधिक से अधिक आत्मविश्वास परमिट. प्रत्येक आत्मीयता चयन के बाद फेज अनुमापांक निगरानी दौर आत्मीयता चयन नकारात्मक नियंत्रण की प्रभावकारिता पर और साथ ही चल रहा है के बारे में जानकारी प्रदान करता है. एक फेज titering, और कैसे के साधन और क्या इस प्रक्रिया के रूप में कुशलतापूर्वक के रूप में प्रगति करने के लिए अनुमति देने के लिए पहले से तैयार करने के लिएसंभव है, प्रस्तुत किया है. स्वतंत्र पट्टिका का अलगाव निम्नलिखित पुनः प्राप्त amplicons के गुण आत्मीयता चयन प्रगति की है कि कैसे अच्छी तरह से पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि डाला जाता है. मुसीबत झूठी सकारात्मक कम करने के लिए या लगातार फेज बरामद बायपास करने के लिए तकनीक की शूटिंग व्याख्या कर रहे हैं. वायरल संदूषण भड़क अप को कम करने के साधन चर्चा कर रहे हैं.
Introduction
क्यों बजाय अन्य अणुओं के साथ प्रोटीन बातचीत की खोज और जांच के लिए उपलब्ध असंख्य अन्य तकनीकों के फेज प्रदर्शन और आत्मीयता चयन का उपयोग करें? फेज प्रदर्शन निम्नलिखित सहित प्रोटीन ligand बातचीत 1-3 पता लगाने के अन्य तरीकों पर कुछ अद्वितीय लाभ का दावा कर सकते हैं:
चारा अणुओं की बहुत व्यापक प्रदर्शनों की सूची
सबसे प्रमुख कारण आत्मीयता चयन 4 में चारे के रूप में कार्य करने में सक्षम अणुओं की विविधता में है. फेज प्रदर्शन एक बहुलक / अणु एक वसूली का समर्थन करने के लिए संलग्न किया जा सकता है, तो अनिवार्य रूप से, यह फेज प्रदर्शित प्रोटीन के साथ आत्मीयता के लिए जांच की जा सकती अन्य प्रोटीन, न्यूक्लियोटाइड, कार्बोहाइड्रेट, 5 आदि के साथ बातचीत कि प्रोटीन टुकड़े को अलग करने का एक बहुत शक्तिशाली माध्यम है. स्थितियां आर करने के लिए इस्तेमाल किया ही, यदि चारा अणु, 6 immobilized जब यह जैविक गतिविधि को बरकरार रखे हुए निर्धारित करने के लिए पहुँचा जा सकता हैअपनी गतिविधि को खत्म / निष्कर्ष निकालना पूर्व आत्मीयता चयन करने के लिए प्रलोभन करने के बाद translational संशोधनों को पेश करने के लिए, 6 प्रभावी या कर रहे हैं.
बाहरी कारकों के फेज प्रतिरोध
फेज प्रदर्शन का उपयोग कर के लिए एक दूसरा कारण, यह कुछ फँसाना चाहे उनकी बातचीत के प्रोटीन पर कब्जा करने के लिए पर्यावरण के तनाव (गर्मी, उच्च osmolyte सांद्रता, विशिष्ट cofactors, आदि.) की आवश्यकता हो सकती है कि संभव है कि है, या फेज प्रदर्शित प्रोटीन किसी तरह बदला जा करना पड़ सकता है आत्मीयता चयन करने से पहले. अध्ययन किया जा रहा प्राथमिक कारक चारा और प्रोटीन, नहीं यह परीक्षण जीव के लिए घातक है अगर बातचीत होने की अनुमति देता है या कि हालत के बीच बातचीत है. यह (T7 व्यवहार्यता के लिए प्रकाशित थर्मल अधिकतम ~ 60 डिग्री सेल्सियस 7 है उदाहरण के लिए) बरकरार है और व्यवहार्य दोनों कठोर प्रयोगात्मक परिस्थितियों का सामना कर सकते हैं क्योंकि T7 फेज इस तरह के अध्ययन के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से अनुकूल है. फेरबदल फेज का एक उदाहरण समर्थक प्रदर्शितमरम्मत एंजाइम प्रोटीन substrates के लिए Arabidopsis thaliana बीज proteome की जांच जब teins, प्रोटीन Isoaspartyl मिथाइल Transferease (PIMT), इन अध्ययनों में इस्तेमाल वायरस परिचय प्रोत्साहित करने के लिए, पहले प्रत्येक आत्मीयता चयन करने के लिए दौर, एक सप्ताह के लिए "वृद्ध" किया गया था isoaspartate की (isoAsp) को समझते हैं और मरम्मत / ऐसी असामान्यताओं metabolize सकता है कि जीवों में संभव नहीं है जो अतिसंवेदनशील प्रोटीन 6 में अवशेष.
Metabolically निष्क्रिय
इसके अलावा, फेज आमतौर पर चयापचय जहर और, कम से कम, metabolically सक्रिय परीक्षण जीवों पर pleiotropic प्रभाव में नतीजा होगा कि छोटे अणुओं हस्तक्षेप करने के लिए प्रतिरोधी रहे हैं. तंगी washes के बाद, जहर जहर बैक्टीरिया या बाद में फेज प्रतिकृति को अहानिकर एक श्रृंखला के लिए पतला है तो बैक्टीरिया की एक बड़ी मात्रा संक्रमण के लिए पेश कर रहे हैं से पहले हटा दिया जाता है. PIMT मरम्मत के लिए प्रोटीन लक्ष्य है जबकि जांचएंजाइम, एस adenosyl Methionine (AdoMet) एंजाइम को निष्क्रिय करने और एक उपयोगी नकारात्मक नियंत्रण में सुरक्षित प्रदान करने के लिए एस adenosyl homocysteine (AdoHcy) पर निर्भर है, जबकि लक्ष्य प्रोटीन कब्जा अनुमति देने के लिए माइक्रो अनुमापांक प्लेट अच्छी तरह से स्थिर एंजाइम सक्रिय करने के लिए इस्तेमाल किया गया था वायरस प्रतिकूल AdoMet या AdoHcy 6 या तो द्वारा प्रभावित नहीं होगा कि ज्ञान. साथ ही, इस प्रयोगशाला में जांच कुछ देर Embryogenesis प्रचुर मात्रा में (एल ई ए) प्रोटीन परिवारों के सदस्य, बिंदु पर सोयाबीन के बीज में 200 मिमी के रूप में उच्च सांद्रता प्राप्त कर सकते हैं जो ऐसे sucrose के रूप में 8 additives, की उपस्थिति में उनके आकार में परिवर्तन करने के लिए जाना जाता है शारीरिक परिपक्वता 9 की. वायरस को स्वतंत्र रूप से व्यावहारिक परीक्षण जीवों 10 के लिए ऐसा नहीं है जो कुछ एल ई ए के ग्राहक प्रोटीन बातचीत के लिए संभवतः आवश्यक प्रत्येक आत्मीयता चयन दौर, में 200 मिमी sucrose के अलावा द्वारा प्रभावित होने की उम्मीद नहीं है.
इस प्रयोगशाला discoverin पर ध्यान केंद्रित किया हैजी प्रोटीन प्रोटीन निर्जलीकरण 11 या बीज 6 आत्मसात किया है एक बार isoAsp गठन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं कि संग्रहीत proteome के घटकों की मरम्मत के दौरान संग्रहित proteome सुरक्षा का तंत्र कायम करना है कि परिपक्व, निर्जलित या germinating बीज में बातचीत. इस प्रकार, उत्पादन और शोधन के एक सक्रिय राज्य में चारे के रूप में आवश्यक पुनः संयोजक प्रोटीन की, और वे स्थिर रहे हैं और इससे पहले के बाद अक्सर मुश्किल, हमारे काम करने के लिए एक आधार है, हालांकि वे, तो रहना सुनिश्चित करना है कि. प्रत्येक पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन परिदृश्य अलग है लेकिन, जैसा कि पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए अनुकूलन की स्थिति यहां संबोधित नहीं किया जाएगा. उपयोगकर्ता (यह एक एंजाइम है अगर microtiter प्लेट कुओं में एक एंजाइम परख करते हैं, उदाहरण के लिए) immobilized प्रोटीन अभी भी कार्य है, यह निर्धारित करने के लिए, जहां भी संभव हो, प्रयास करने के लिए आग्रह कर रहे हैं. यह किसी भी खोज की बातचीत कर रहे हैं कि, चारा इसलिए जैविक रूप से सक्रिय है और कुछ विश्वास है कि प्रदान करेगाजैविक प्रासंगिकता है करने के लिए कुछ और अधिक होने की संभावना है.
Protocol
Representative Results
Discussion
तीन दोहराया कुओं में प्रयोग चल रहे हैं, चारा के लिए बाध्य ही प्रोटीन की स्वतंत्र रूप से प्राप्त कर लिया फेज वे एक ही क्लोन का अधिग्रहण किया गया है कि सीडीएस क्षेत्र के nucleotide अनुक्रम में (यानी कोई अंतर न?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हैच, McIntire-Stennis (AD421 सीआरआईएस), यूएसडीए बीज अनुदान (2011-04375), और अब्द सर फ्रेडरिक मैकमास्टर रिसर्च फैलोशिप, इस परियोजना के लिए आंशिक रूप से एक NSF IOS (0849230) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
