組換えタンパク質ベイトを用いてファージディスプレイおよび親和性選択のためのプロトコル
Summary
ファージディスプレイは、関心対象の固定化分子と相互作用するタンパク質又はタンパク質部分をキャプチャするための強力な技術である。作成するファージcDNAライブラリーの種類や画面の決定がなされると、ここで説明するプロトコルは、相互作用物質の同定をもたらす効率的な親和性選択を可能にする。
Abstract
固定化ベイト分子に方向性クローニングされたcDNAライブラリーによってコードされる種々のタンパク質部分を提示するための足場として組換えファージを使用して、相互作用を発見するための効率的な手段である。技術は、主に、タンパク質 – タンパク質相互作用を発見するために使用されてきたが、チャレンジするベイト分子がタンパク質に限定される必要はない。ここで紹介するプロトコルは、餌の適度な数が同じタンパク質を提示する独立したクローンの同定を最大化するために反復してスクリーニングすることができるように最適化されている。これは、識別された相互作用するタンパク質を餌分子の合法的な相互作用因子であることを大きな自信を可能にします。各親和性選択後にファージ力価のモニタリングは、ラウンドの親和性選択はネガティブコントロールの有効性についてだけでなく、進行している方法に関する情報を提供しています。一つのファージを力価測定する手段と、どのように、どのようなこのプロセスは限り効率として進行させるために、事前に準備する可能では、提示される。独立したプラークを単離した後取り出したアンプリコンの属性は、親和性選択が進行しているどれだけ確認するために使用することができることを強調している。誤検知を最小限に抑えるか、永続的に回収したファージをバイパスするためにトラブルシューティングの技術が説明されています。ウイルス汚染を減少させる手段が議論されて燃え上がる。
Introduction
なぜファージディスプレイおよび親和性選択は、他の分子とタンパク質の相互作用を発見し、調査するための利用可能な無数の他の技術の代わりに使用？ファージディスプレイは、次のようなタンパク質-リガンド相互作用1-3を検出する他の方法に比べていくつかのユニークな利点を請求することができます。
餌分子の非常に広いレパートリー
最も重要な理由は、親和性選択4に餌として作用することができる分子の多様性にある。ファージディスプレイは、ポリマー/分子が回収支持体に付着させることができる場合には本質的に、それは、ファージ表示されたタンパク質との親和性についてスクリーニングすることができる他のタンパク質、ヌクレオチド、炭水化物、 等 5と相互作用するタンパク質フラグメントを単離する非常に強力な手段である。条件をrに加えて使用される場合、ベイト分子は、6を固定化したときに生物学的活性を保持するかどうかを決定するためにアクセスすることができるその活性を除去する/引き出す親和性選択の前に餌の翻訳後修飾を導入するために、6又は有効である。
無関係な要因によるファージ耐性
それはいくつかの餌がその相互作用タンパク質、またはファージ表示されたタンパク質を捕捉するために環境ストレス（熱、高浸透圧調節物質濃度が、特定の補助因子、等 。）を必要とする可能性があるということであるファージディスプレイを使用するための第二の理由は、何らかの方法で改変される必要があり得る親和性選択の前に。研究されている主な要因は、餌とタンパク質、ではないが、試験生物に致死的である場合には相互作用が発生することを可能にするか、条件の間の相互作用である。それは（T7生存率の公表サーマル最大値は〜60℃で7でEG）無傷で、生存の両方過酷な実験条件に耐えることができるので、T7ファージは、そのような研究に特に適しています。プロファージディスプレイを変化させることの一例として修復酵素のタンパク質基質のためのシロイヌナズナ種子プロテオームを調べるときteinsは、タンパク質イソアスパメチルトランスフェラーゼ（PIMT）は、これらの研究で使用されるウイルスは、導入を奨励するために、以前の各親和性選択へのラウンド、1週間、「高齢者」だったイソアスパラギン酸の認識と修復/このような異常を代謝することができる生物では不可能である影響を受けやすいタンパク質6（イソAsp）残基。
代謝的に不活性
さらに、ファージは、通常、代謝毒と、少なくとも、代謝活性のある試験生物に対する多面的な効果をもたらすであろう小分子干渉に対して耐性である。ストリンジェンシー洗浄の後、毒は毒が細菌やその後のファージ複製に無害な範囲に希釈されるので、細菌の大ボリュームが感染のために導入される前に削除されます。 PIMT修復のタンパク質標的を調査しながら、酵素、S-アデノシルメチオニン（AdoMetは）はで固定し、酵素を不活性化し、有用なネガティブコントロールを提供するために、S-アデノシルホモシステイン（AdoHcy）に依拠しながら、標的タンパク質の捕捉を可能にするマイクロタイタープレートウェル固定化酵素を活性化するために使用されたウイルスが悪のAdoMetやAdoHcy 6のどちらかに影響されないであろうという知識。さらに、特定の後期胚形成のメンバーは、この研究室で調査豊富（LEA）タンパク質ファミリーは、このような点で、ダイズ種子中の200mMの高濃度を得ることができるスクロース8、のような添加剤の存在下でその形状を変えることが知られている生理学的成熟度9の。ウイルスは、自律的に実行可能な試験生物10の場合ではない、特定のLEAクライアントタンパク質相互作用のための可能性に必要な各アフィニティー選択ラウンド、200 mMスクロースの添加によって影響されると予想されていません。
このラボでは、discoverinに焦点を当てている脱水11または種子を06吸収された後イソAsp形成を受けやすい記憶されたプロテオームの構成部品の修理中に記憶されたプロテオームの保護機構の根底にある、成熟した脱水もしくは発芽種子におけるgタンパク質-タンパク質相互作用。このため、生産、精製、アクティブ状態の餌として必要な組換えタンパク質の、それらが固定化される前と後しばしば困難、我々の仕事への基礎となるものですが、彼らは、そうしたままであることを確認。それぞれの組換えタンパク質生産のシナリオが異なるしかしながら、組換えタンパク質生産のための最適条件は、ここでは扱われないでしょう。ユーザは、（それが酵素である場合には、例えば 、マイクロタイタープレートウェルに酵素アッセイを行う）固定化されたタンパク質が依然として機能しているかどうかを決定するために、可能な限り試みるように付勢されている。これは、任意の発見の相互作用があることを、餌がありますので、生物学的に活性であり、いくつかの信頼性を提供しますもう少し生物学的関連性を有する可能性が高い。
Protocol
Representative Results
Discussion
3レプリケートウェルで実験を実行することにより、ベイトと結合する同じタンパク質の独立して取得されたファージは、それらが同じクローン取得されたCDS領域のヌクレオチド配列（ すなわち、差がないが、これらがされている場合であっても区別することができる独立した井戸から取得した）。それらは独立してヌクレオチド配列の一部が異なる転写領域を逆にしているそれ以外?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトは、部分的に、NSF IOS（0849230）によって賄われていた、ハッチ、マッキンタイア·ステニス（AD421 CRIS）、USDAのシード·グラント（2011から04375）、そしてサー·フレデリック·マクマスター研究員ABDに。
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
