פרוטוקול לתצוגת הפאג וזיקה בחירה באמצעות פיתיונות חלבון רקומביננטי
Summary
תצוגת הפאג היא טכניקה רבת עוצמה כדי ללכוד חלבונים או moieties חלבון הפועלים באינטראקציה עם מולקולה משותקת של עניין. ברגע שהחלטה מהסוג של ספריית cDNA הפאג ליצור והמסך נעשתה, הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר בחירת זיקה יעילה שמוביל לזיהוי של interactors.
Abstract
שימוש הפאג רקומביננטי כפיגום להציג מנות חלבון שונות המקודדים על ידי ספריית cDNA המשובטת directionally למולקולות פיתיון משותקים הוא אמצעי יעיל כדי לגלות אינטראקציות. הטכניקה במידה רבה נעשתה שימוש כדי לגלות אינטראקציות בין חלבונים אבל מולקולת הפיתיון להיות אתגר לא צריכה להיות מוגבלת לחלבונים. הפרוטוקול המובא כאן בצורה מיטבית כדי לאפשר למספר צנוע של פיתיונות שיוקרנו בחזרות על מנת למקסם את זיהוי של שיבוטים עצמאיים המציגים אותו החלבון. זה מאפשר ביטחון רב יותר שחלבוני אינטראקציה שזוהו הם interactors הלגיטימי של מולקולת הפיתיון. ניטור כייל הפאג לאחר כל בחירת זיקה עגולה מספק מידע על אופן בחירת הזיקה מתקדמת, כמו גם על יעילותן של בקרות שליליות. אמצעי אחד titering הפאג, ואיך ומה להכין מראש כדי לאפשר את התהליך הזה כדי להתקדם בצורה יעילה ככלאפשרי, מוצג. תכונות של amplicons לאחזר הבאים בידוד של פלאק העצמאי מודגשות כי ניתן להשתמש כדי לברר כיצד גם מבחר הזיקה התקדם. פתרון בעיות טכניקות כדי למזער את התוצאות החיוביות שגויות או לעקוף בהתמדה התאושש הפאג מוסברים. אמצעי להפחתת זיהום נגיפית התלקחות הם דנו.
Introduction
למה להשתמש בתצוגת הפאג ובחירת זיקה במקום טכניקות אחרות עצום זמינות לגילוי וחקירת אינטראקציות חלבון עם מולקולות אחרות? תצוגת הפאג יכולה לטעון כמה יתרונות ייחודיים על פני שיטות אחרות לזיהוי אינטראקציות חלבון ליגנד 1-3 כוללים את הפעולות הבאות:
רפרטואר רחב מאוד של מולקולות פיתיון
הסיבה החשובה ביותר היא בגיוון של מולקולות מסוגלות לפעול כפיתיון בבחירת זיקת 4. תצוגת הפאג היא אמצעי חזק מאוד של בידוד שברי חלבון הפועלים באינטראקציה עם חלבונים אחרים, נוקלאוטידים, פחמימות, וכו '5 בעיקרו של דבר, אם פולימר / מולקולה יכולה להיות מחוברת לתמיכת ההשבה, זה יכול להיות מוקרן לזיקה עם חלבונים המוצגים הפאג. בנוסף, מולקולת הפיתיון ניתן לגשת כדי לקבוע אם הוא שומר על פעילות ביולוגית כאשר משותק 6, אם תנאים המשמשים לrלהסיק / לחסל את פעילותו יעיל 6 או, להציג את השינויים שלאחר translational לפיתיון לפני בחירת זיקה.
התנגדות הפאג לגורמים חיצוניים
סיבה שנייה לשימוש בתצוגת הפאג, היא שזה אפשרי כי כמה פיתיונות עשויים לדרוש לחץ סביבתי (חום, ריכוזי osmolyte גבוהים, cofactors הספציפי, וכו '.) כדי ללכוד חלבוני האינטראקציה שלהם, או החלבונים המוצגים הפאג ייתכן שיהיו הצורך לשנות איכשהו לפני בחירת זיקה. הגורם העיקרי שלמד הוא האינטראקציה בין הפיתיון וחלבון, לא המצב שמאפשר האינטראקציה להתרחש או אם הוא קטלני לאורגניזם המבחן. הפאג T7 הוא גם מתאים במיוחד למחקרים כאלה, כי זה יכול לעמוד בתנאי ניסוי קשים שניהם שלמים ובת קיימא (למשל מרבי התרמית פורסם לכדאיות T7 הוא ~ 60 ° C 7). כדוגמא לשינוי הפאג מוצג פרוteins, כאשר בוחן את proteome זרע thaliana ארבידופסיס למצעי חלבון של אנזים התיקון, חלבון Isoaspartyl תיל Transferease (PIMT), הווירוס המשמש במחקרים אלה היה "בני" במשך שבוע אחד, לפני כל בחירת זיקה עגולה, כדי לעודד הקדמה של isoaspartate (isoAsp) שאריות צמחים בחלבונים רגישים 6 דבר שאינו אפשרי באורגניזמים שיכולים לזהות ולתקן / לעכל מומים כאלה.
מטבולית אינרטי
יתר על כן, הפאג הם בדרך כלל עמיד בפני רעלים מטבוליים ומפריע מולקולות קטנות שהייתי, לכל הפחות, לגרום לתופעות pleiotropic על אורגניזמים בדיקה פעילים מטבולית. בעקבות שטיפות חומרא, הרעל מוסר לפני נפח גדול של חיידקים הם הציגו לזיהום כל כך הרעל מדולל למגוון בלתי מזיק לחיידקים או שכפול הפאג שלאחר מכן. בעוד חקירת מטרות חלבון של תיקון PIMTאנזים, S-Adenosyl מתיונין (AdoMet) שימש כדי להפעיל את האנזים משותק מייקר כייל צלחת היטב כדי לאפשר לכידת חלבון מטרה תוך הסתמכות על S-Adenosyl הומוציסטאין (AdoHcy) כדי להשבית את האנזים ולספק שליטה שלילית שימושית לאבטח ב הידיעה שהווירוס לא להיות מושפע לרעה על ידי אחד AdoMet או AdoHcy 6. בנוסף, בני משפחות מסוימות המאוחר עובר חלבון נפוץ (LEA), נחקרו במעבדה זו, ידועים לשנות את צורתם בנוכחות תוספים כגון סוכרוז 8, שיכול להשיג ריכוזים גבוהים ככל 200 מ"מ בזרעי סויה בנקודה בשלות פיזיולוגית 9. הווירוס לא צפוי להיות מושפע על ידי תוספת של 200 סוכרוז מ"מ בכל סיבוב זיקת בחירה, אולי הכרחי לאינטראקציות חלבון LEA לקוח מסוימות, וזה לא במקרה של אורגניזמים מבחן מעשי באופן אוטונומי 10.
מעבדה זו מתמקדת בdiscoverinאינטראקציות בין חלבונים G בזרעים בוגרים, מיובשים או נובטים העומדים בבסיס המנגנון של הגנת proteome המאוחסנת במהלך התייבשות 11 או תיקון של רכיבים של proteome המאוחסנת, כי הם רגישים להיווצרות isoAsp פעם הזרע ספג 6. לפיכך, הייצור והטיהור של החלבונים רקומביננטי הנדרשים כפיתיון במצב פעיל, ולהבטיח שהם יישארו כך, לפני ואחרי שהם משותקים, אם כי קשים לעתים קרובות, הוא אבן יסוד לעבודה שלנו. עם זאת, כמו כל תרחיש ייצור חלבון רקומביננטי הוא שונה, תנאי אופטימיזציה לייצור חלבון רקומביננטי לא התייחסו כאן. משתמשים מתבקשים לנסות, בכל מקום אפשרי, כדי לקבוע אם החלבון המשותק הוא עדיין פונקציונלי (למשל, אם זה הוא אנזים, לעשות assay אנזים בבארות צלחת microtiter). זה יספק קצת ביטחון שהפיתיון הוא פעיל מבחינה ביולוגית ואם כן, כי כל אינטראקציות שהתגלו הןקצת יותר סיכוי יש להם שייכות ביולוגית.
Protocol
Representative Results
Discussion
על ידי הפעלת הניסוי בשלוש בארות משוכפלים, ניתן להבחין הפאג שנרכש באופן עצמאי של אותו החלבון מחייב את הפיתיון גם אם הם זהה שיבוט (כלומר אין הבדל ברצף נוקליאוטידים של אזור CDS שכבר נרכש, אבל אלה היו נאסף מבארות עצמאיות). אחרת, הדרך היחידה להבחין בין הפאג קידוד אותו הח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה מומן באופן חלקי על ידי IOS NSF (0849230); האץ', McIntire-סטניס (AD421 קריס), גרנט USDA זרע (2011-04,375), וסר פרדריק מקמאסטר מחקר מלגה לABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
