En protokol for fagvisning og Affinity Selection Brug rekombinant protein Lokkemad
Summary
Fag-display er en kraftfuld teknik til at fange proteiner eller proteingrupper, der interagerer med et immobiliseret molekyle af interesse. Når først en beslutning om, hvilken type fag cDNA bibliotek til at oprette og skærmen er blevet foretaget, protokollen beskrevet her tillader effektiv affinitet udvælgelse fører til identifikation af interaktionskandidater.
Abstract
Ved hjælp af rekombinant fag som et stillads til at præsentere forskellige proteindele kodet af en retningsbestemt klonet cDNA-bibliotek til immobiliserede agn molekyler er et effektivt middel til at opdage interaktioner. Teknikken er i vid udstrækning blevet anvendt til at opdage protein-protein interaktioner, men agn molekyle udfordres behøver ikke være begrænset til proteiner. Protokollen præsenteres her er optimeret til at give et beskedent antal lokkemad, der skal screenes i replikater at maksimere identifikation af uafhængige kloner, der frembyder den samme protein. Dette tillader en større tillid til, at interagerende proteiner identificeret, er legitime interaktionskandidater af agn molekylet. Overvågning fagtiteren efter hvert valg affinitet runde indeholder oplysninger om, hvordan valget affinitet forløber såvel som på effekten af negative kontroller. Et middel til titrering af fag, og hvordan og hvad man skal forberede sig på forhånd til at tillade denne proces at gøre fremskridt så effektivt somer muligt, præsenteres. Attributter for amplikoner hentes efter isolation af uafhængige plaque er fremhævet, kan anvendes til at konstatere, hvor godt valg affinitet der er forløbet. Fejlfinding teknikker til at minimere falske positiver eller at omgå vedvarende genvundet fag forklares. Middel til at reducere viral kontaminering blusser op diskuteres.
Introduction
Hvorfor bruge fagvisning og affinitet udvalg i stedet for de utallige andre teknikker til rådighed for at opdage og undersøge protein interaktioner med andre molekyler? Fagvisning kan kræve nogle unikke fordele i forhold til andre metoder til påvisning af protein-ligand interaktioner 1-3, herunder følgende:
Meget bredt repertoire af agn molekyler
Den forreste Årsagen er i mangfoldigheden af molekyler, der kan fungere som lokkemad i affinitet udvalg 4. Fagvisning er et meget effektivt middel til at isolere protein fragmenter, der interagerer med andre proteiner, nukleotider, kulhydrater osv. 5. Væsentlige, hvis en polymer / molekyle kan knyttes til en genindvindingsværdi støtte, det kan screenes for affinitet med fag viste proteiner. Derudover kan tilgås agn molekyle at afgøre, om det bevarer biologisk aktivitet, når immobiliseret 6, hvis betingelserne for at reduce / fjerne dens aktivitet er effektive 6 eller at indføre post-translationelle modifikationer til agn før affinitet valg.
Fagresistens til eksterne faktorer
En anden grund til anvendelse af fag-display, er, at det er muligt, at nogle lokkemad kan kræve miljøbelastninger (varme, høje osmolyt koncentrationer specifikke cofaktorer osv.) Til at fange deres interagerende proteiner, eller muligvis en eller anden måde ændret fag viste proteiner før affinitetsudvælgelse. Den primære faktor, der undersøges er samspillet mellem agn og protein, ikke den betingelse der tillader interaktion forekomme, eller hvis det er dødelig for testorganismen. T7-fagen er særligt velegnet til sådanne undersøgelser, fordi det kan modstå barske eksperimentelle betingelser både intakte og levedygtige (fx den termiske maksimale offentliggøres T7 levedygtighed er ~ 60 ° C 7). Som et eksempel på ændring fagen vises proproteiner, når man undersøger Arabidopsis thaliana frø proteom for proteinsubstrater af reparation enzym, Protein Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), den virus, der anvendes i disse undersøgelser havde været "ældet" i en uge, før hvert valg affinitet runde, for at fremme en af isoaspartate (isoAsp) rester i modtagelige proteiner 6 hvilket ikke er muligt i organismer, der kan genkende og reparere / nedbryde sådanne abnormiteter.
Metabolisk inaktive
Endvidere fagen er normalt modstandsdygtige over for metaboliske giftstoffer og blande små molekyler, ville i det mindste resultere i pleiotrope virkninger på metabolisk aktive testorganismer. Efter stringens-vaske giften fjernes før en stor mængde af bakterier indføres for infektion så giften fortyndes til et område uskadeligt for disse bakterier eller efterfølgende fag-replikation. Mens undersøge protein-targets i PIMT reparationenzym, blev S-adenosylmethionin (AdoMet) anvendes til at aktivere mikro-titer-pladet godt immobiliserede enzym til at tillade målprotein capture mens afhængige S-adenosyl homocystein (AdoHcy) for at inaktivere enzymet og give en nyttig negativ kontrol sikre i den viden, at virusset ikke ville blive negativt påvirket af enten AdoMet eller AdoHcy 6. Derudover medlemmer af visse sen embryogenese Abundant (LEA) protein familier, undersøgt i dette laboratorium, er kendt for at ændre deres form i nærvær af additiver, såsom saccharose, 8, der kan nå så høje koncentrationer som 200 mM i sojabønnefrø ved punktet af fysiologiske modenhed 9. Virussen forventes ikke at blive påvirket ved tilsætning af 200 mM saccharose i hver affinitet udvælgelsesrunde, eventuelt nødvendigt visse LEA-client protein-interaktioner, hvilket ikke er tilfældet for autonomt levedygtige testorganismer 10.
Dette laboratorium har fokuseret på discovering protein-protein interaktioner i modne, tørrede eller spirende frø, der ligger bag den mekanisme af lagret proteom beskyttelse under dehydrering 11 eller reparation af dele af den lagrede proteom der er modtagelige for isoAsp dannelse, når frøene er drukket 6. Således produktion og rensning af rekombinante proteiner, der kræves som lokkemad i en aktiv tilstand, og sikre, at de forbliver det, før og efter de er immobiliseret, skønt ofte svært, er en hjørnesten i vores arbejde. Men da hver produktion af rekombinant protein scenario er anderledes, optimere betingelserne for produktion af rekombinante proteiner vil ikke blive behandlet her. Brugerne opfordres til at forsøge så vidt muligt at fastslå, om det immobiliserede protein er stadig funktionel (fx hvis det er et enzym, gøre et enzym assay i mikrotiterpladebrøndene). Det vil give nogle tillid til, at agn er biologisk aktive, og derfor, at eventuelle opdaget interaktioner ernoget mere tilbøjelige til at have biologiske relevans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved at køre eksperiment i tre replikerede brønde, uafhængigt kan erhverves phag samme proteinbinding til agn skelnes, selv om de er de samme klon (dvs. ingen forskel i nukleotidsekvensen CDS region, der er opnået, men disse har været hentet fra uafhængige brønde). Ellers er den eneste måde at skelne mellem fager, der koder for det samme protein binding til agn er, hvis de uafhængigt er revers transkriberet regioner, der adskiller sig i en del af nukleotidsekvensen.
Anvendel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev delvist finansieret af en NSF IOS (0849230), Hatch, Mclntire-Stennis (AD421 CRIS), USDA Seed Grant (2011-04.375), og Sir Frederick McMaster Research Fellowship til ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
References
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
