में चेहरे प्रत्यारोपण<em> Xenopus laevis</em> भ्रूण
Summary
Xenopus के बीच चेहरे ऊतक "चरम पूर्वकाल डोमेन" रोपाई के लिए एक तकनीक भ्रूण विकसित किया गया है laevis. ऊतक craniofacial विकास के लिए और चेहरे क्षेत्रों के बीच बातचीत के संकेत के लिए स्थानीय आवश्यकताओं के अध्ययन की अनुमति, दूसरे में एक जीन की अभिव्यक्ति पृष्ठभूमि से ले जाया जा सकता है.
Abstract
Craniofacial जन्म दोष 1 700 हर के बाहर जीवित जन्मों में होते हैं, लेकिन एटियलजि शायद ही कभी कारण craniofacial विकास की सीमित समझ के लिए जाना जाता है. संकेत दे रास्ते और ऊतकों के विकास के चेहरे की patterning के दौरान कार्य की पहचान जहां, एक 'चेहरा प्रत्यारोपण' तकनीक मेंढक Xenopus laevis की भ्रूण में विकसित किया गया है. प्रकल्पित चेहरे ऊतक ("चरम पूर्वकाल डोमेन" (ई.)) के एक क्षेत्र tailbud चरण में एक दाता भ्रूण से हटा दिया, और बराबर क्षेत्र हटा दिया गया है, जिसमें से एक ही मंच से एक मेजबान भ्रूण को प्रत्यारोपित किया जाता है. यह मेजबान या दाता ऊतक एक जीन में एक हानि या समारोह के लाभ है, और / या एक वंश लेबल भी शामिल है जहां एक chimeric चेहरा उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चेहरे क्षेत्र में आसानी से बड़ी है और के रूप में उपचार के बाद, विकास के परिणाम पर नजर रखी, और दाता या आसपास के मेजबान के ऊतकों के भीतर संकेतन मार्ग की भूमिका को इंगित करता है. Xenopus, चेहरा विकास के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल है एकmicromanipulation के लिए ccessible. विकास तेजी से होता है के बाद से कई भ्रूण एक कम समय की अवधि में, assayed किया जा सकता है. Craniofacial प्रक्रियाओं Xenopus और स्तनधारियों के बीच संरक्षित दिखाई देते हैं मेंढक में निष्कर्ष, मानव विकास के लिए प्रासंगिक हैं.
Introduction
Craniofacial विकास के दौरान craniofacial जन्म दोष 1-2, महत्वपूर्ण ऊतकों और उनके संकेत योगदान अंतर्निहित तंत्र को समझने की पहचान की जानी चाहिए. मेंढक Xenopus laevis, बाह्य त्वक स्तर और अन्तर्जनस्तर सीधे 3-4 juxtaposed हैं, जहां "चरम पूर्वकाल डोमेन" (ई.), से मुंह और नाक के फार्म सहित चेहरे का हिस्सा, में. EAD भी जबड़े और चेहरे अन्य क्षेत्रों 5 रूपों जो कपाल तंत्रिका शिखा, सहित आसपास के ऊतकों को प्रभावित करने के लिए एक संकेत केंद्र के रूप में कार्य करता है. ऊतक इसी मेजबान क्षेत्र को हटाने के बाद, एक मेजबान भ्रूण में एक दाता से प्रत्यारोपित किया जाता है जहां EAD समारोह में योगदान देने वाले जीन की पहचान करने के लिए, एक 'चेहरा प्रत्यारोपण' तकनीक विकसित की गई थी. प्रत्यारोपण के बाद, चेहरे का विकास परिणामस्वरूप मूल्यांकन किया है. इस प्रकार, समारोह के नुकसान (LOF) या ई. में एक विशेष जीन के लिए समारोह (GOF) के लाभ के प्रभाव, स्थानीय स्तर पर विश्लेषण कर रहे हैं, जहां घंटे का आरामEAD और शरीर जंगली प्रकार के ऊतकों से बना है. जंगली प्रकार के ऊतकों विशिष्ट जीन में वैश्विक LOF या GOF के साथ भ्रूण में प्रत्यारोपित किया जाता है जहां पारस्परिक प्रत्यारोपण, प्रदर्शन किया जा सकता है. ट्रांसप्लांटेशन अक्सर Xenopus में इस्तेमाल किया गया है और लड़की 6 अध्ययन करता है. उदाहरण के लिए, Xenopus प्रत्यारोपण स्वजातीय तंत्रिका प्रेरण, लेंस और तंत्रिका क्षमता, और तंत्रिका शिखा प्रवास 7-10 संबोधित किया गया है. बटेर चिकी कैमेरिक ग्राफ्टिंग पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट, पूर्वकाल तंत्रिका रिज, तंत्रिका शिखा, और कपाल हड्डियों 11-14 के विकास का विश्लेषण किया गया है. इस Xenopus में craniofacial विकास के अध्ययन के लिए पहला प्रत्यारोपण तकनीक है. इस तकनीक प्रकल्पित मुंह 5 में तहखाने झिल्ली गठन को विनियमित करने में Wnt inhibitors Frzb1 और वर्धमान के लिए एक उपन्यास भूमिका का प्रदर्शन किया है. Xenopus laevis craniofacial विकास के अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है भ्रूण बड़े हैं, के रूप में, बाहर से विकसित एकएन डी चेहरे की अनुमति, दिखाई आसानी micromanipulation और विकास की इमेजिंग. चेहरे का विकास अंतर्निहित तंत्र मेंढक में किए गए निष्कर्षों मानव विकास 4,15-16 में अंतर्दृष्टि प्रदान का संकेत है कि संरक्षित दिखाई देते हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
गंभीर कदम और सीमाएं: ई. चेहरा प्रत्यारोपण प्रक्रिया समय है और गहन काम करते हैं. यह सही करने के लिए अभ्यास, स्थिर हाथ, और निपुणता की आवश्यकता है. चेहरा प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल कुशलता से हटाने और प्रत्यार…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मेंढक पशुपालन और भ्रूण तैयार करने के साथ सहायता के लिए उनकी मदद के लिए Radek Sindelka, और कैस Bresilla धन्यवाद. इस काम एचएलएस लौरा Jacox को अनुदान R01DE021109 के माध्यम से NIH द्वारा वित्त पोषित किया गया हार्वर्ड विश्वविद्यालय में हर्शेल स्मिथ ग्रेजुएट फैलोशिप और एक F30 व्यक्ति फैलोशिप अनुदान F30DE022989-01 NIDCR के माध्यम से वित्त पोषित किया गया.
Materials
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4’’ | Cotton Plugged | ||
| Disposable | |||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| Polyethylene | |||
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45 degrees |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip |
| Stainless Steel; | |||
| 20cm long | |||
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0mm OD x 0.5mm ID/Fiber |
| 100mm each | |||
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24x60mm |
| micro cover glass | or | or | |
| (for glass bridges) | 48393 230 | 24x40mm | |
| No.1.5 | |||
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00mm square box filaments, 3.0mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| (discontinued) | |||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Zeiss Stemi 1000 | |||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 17cm | |||
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0 to 1mm |
| Length: 12cm | |||
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
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