Astrocytic ट्रांसपोर्टर धाराओं के एक Deconvolution विश्लेषण के साथ ग्लूटामेट क्लीयरेंस का टाइम कोर्स पाने
Summary
हम astrocytes में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग से astrocytic झिल्ली में ग्लूटामेट का जीवनकाल अनुमान लगाने के लिए एक विश्लेषणात्मक विधि का वर्णन है.
Abstract
मस्तिष्क में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों के उच्चतम घनत्व astrocytes में पाया जाता है. 3 ना + और 1 एच के सह परिवहन + और 1 कश्मीर की जवाबी परिवहन के साथ झिल्ली भर ग्लूटामेट की ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों जोड़ी आंदोलन +. परिवहन प्रक्रिया द्वारा उत्पन्न stoichiometric वर्तमान astrocytes से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के साथ नजर रखी जा सकती है. दर्ज वर्तमान के समय के पाठ्यक्रम जो astrocytes के सामने आ रहे हैं ग्लूटामेट एकाग्रता प्रोफाइल, ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों के कैनेटीक्स, और astrocytic झिल्ली के निष्क्रिय इलेक्ट्रोटोनिक गुणों के समय के पाठ्यक्रम के आकार का है. यहाँ हम astrocytes में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं रिकॉर्ड और astrocytic ट्रांसपोर्टर धाराओं की तरंग को आकार कि अन्य सभी कारकों से ग्लूटामेट निकासी के समय के पाठ्यक्रम को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रयोगात्मक और विश्लेषणात्मक विधियों का वर्णन. यहाँ वर्णित विधि जीवनकाल ओ का अनुमान किया जा सकता हैच फ्लैश Uncaged और स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के किसी भी क्षेत्र में astrocytic झिल्ली में ग्लूटामेट synaptically में जारी की.
Introduction
Astrocytes स्टार के आकार और आकृति विज्ञान neuropil में विस्तार और पड़ोसी synaptic संपर्कों 1,2 तक पहुँचने कि ठीक झिल्ली protrusions के साथ दिमाग में सबसे प्रचुर प्रकार की कोशिकाओं में से एक हैं. astrocytes 'कोशिका झिल्ली घनी ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर अणुओं 3 के साथ पैक किया जाता है. शारीरिक शर्तों के तहत, ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों तेजी झिल्ली के बाह्य पक्ष में ग्लूटामेट बाँध और सेल cytoplasm को हस्तांतरण. ऐसा करके, ट्रांसपोर्टरों बाह्य अंतरिक्ष 4 में ग्लूटामेट की कम बेसल एकाग्रता बनाए रखें. Synapses के उत्तेजक से सटे ठीक astrocytic प्रक्रियाओं में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों आदर्श इसे दूर synaptic फांक से diffuses रूप अन्तर्ग्रथनी घटनाओं के दौरान जारी ग्लूटामेट बाध्य करने के लिए तैनात कर रहे हैं. ऐसा करके, ट्रांसपोर्टरों भी उत्तेजक संकेत के स्थानिक प्रसार को कम करने, पेरी और अतिरिक्त अन्तर्ग्रथनी क्षेत्रों की दिशा में और पड़ोसी synapses पर ग्लूटामेट spillover सीमा5-7 मस्तिष्क में है.
ग्लूटामेट परिवहन stoichiometrically 3 के आंदोलन करने के लिए मिलकर एक electrogenic प्रक्रिया है ना + और 1 एच उनके विद्युत ढाल के साथ + और 1 + K 8 की जवाबी परिवहन के लिए. (Thiocyanate)> सं 3 – (- नाइट्रेट) ≈ क्लोरीन मोनोऑक्साइड 4 – (perchlorate)> मैं -> बीआर -> सीएल -> एफ – नहीं ग्लूटामेट परिवहन कारण बताओ सूचना को पारगम्य (लेकिन stoichiometrically लिए युग्मित नहीं) एक anionic चालकता के साथ जुड़ा हुआ है (मीथेन सल्फ़ोनेट) और सी 6 एच 11 हे – 7 – (ग्लूकोनेट) 9-11 सीएच 3 तो 3 से. दोनों धाराओं (stoichiometric और गैर stoichiometric) नेत्रहीन acut में Dodt रोशनी या बुनियादी लाल अंतर हस्तक्षेप विपरीत (आईआर डीआईसी) के तहत पहचान astrocytes, से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के द्वारा दर्ज किया जा सकताई मस्तिष्क स्लाइसें 12. झिल्ली भर ग्लूटामेट परिवहन के साथ जुड़े वर्तमान की stoichiometric घटक सीएच 3 तो 3 का उपयोग कर से अलग किया जा सकता है – या सी 6 एच 11 हे 7 – आधारित इंट्रासेल्युलर समाधान और astrocytes 13,14 पर फ्लैश uncaging ग्लूटामेट द्वारा पैदा किया जा सकता है, या पड़ोसी synapses से ग्लूटामेट रिहाई सक्रिय द्वारा, या तो विद्युत 12 या एक लक्षित optogenetic नियंत्रण के साथ.
ट्रांसपोर्टर वर्तमान की stoichiometric घटक के समय पाठ्यक्रम astrocytic झिल्ली (यानी ग्लूटामेट निकासी) में ग्लूटामेट एकाग्रता प्रोफ़ाइल के जीवनकाल के आकार का है, ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टरों, astrocytes के निष्क्रिय झिल्ली गुण के कैनेटीक्स, और द्वारा अन्तर्ग्रथनी stimulations के दौरान सक्रिय synapses के 13 पार ग्लूटामेट रिहाई की समक्रमिकता. यहाँ हम पूर्ण विस्तार से वर्णन है: (1) एक प्रयोगात्मक apprएक उदाहरण के प्रयोगात्मक तैयारी के रूप में तीव्र माउस hippocampal स्लाइस का उपयोग कर astrocytes से पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग से ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं के stoichiometric घटक अलग करने के लिए oach, (2) एक विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण इन रिकॉर्डिंग 13 से ग्लूटामेट निकासी के समय पाठ्यक्रम प्राप्त करने के लिए 14. इन विधियों रिकॉर्ड और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के किसी भी क्षेत्र में astrocytes से ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ हम astrocytes से electrophysiological रिकॉर्डिंग प्राप्त करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, astrocytes में ग्लूटामेट ट्रांसपोर्टर धाराओं को अलग करने के लिए एक विश्लेषणात्मक प्रोटोकॉल और करने के लिए एक गणितीय …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक के अंदर का रिसर्च प्रोग्राम (NS002986) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. के रूप में पांडुलिपि लिखा था और deconvolution विश्लेषण लागू किया है. JSD deconvolution विश्लेषण के प्रारंभिक संस्करण विकसित और पाठ पर टिप्पणी की.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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