Derivando La durata di Liquidazione glutammato con una analisi Deconvoluzione delle Correnti Transporter astrociti
Summary
Descriviamo un metodo analitico per stimare la durata del glutammato a membrane di astrociti da registrazioni elettrofisiologiche delle correnti trasportatore del glutammato negli astrociti.
Abstract
La più alta densità di trasportatori del glutammato nel cervello è trovato in astrociti. Glutammato trasportatori coppia il movimento del glutammato attraverso la membrana con il co-trasporto di Na + e 3 1 H + e la contro-trasporto di K + 1. La corrente stechiometrico generata dal processo di trasporto può essere monitorato con cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti. L'andamento temporale della corrente registrata è modellato dalla decorso temporale del profilo glutammato concentrazione a cui sono esposti gli astrociti, la cinetica di trasportatori del glutammato, e le proprietà elettrotoniche passivi di membrane astrociti. Qui si descrivono i metodi sperimentali e analitici che possono essere utilizzati per registrare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e isolare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato da tutti gli altri fattori che determinano la forma d'onda delle correnti trasportatore astrociti. I metodi qui descritti possono essere utilizzati per stimare la durata of flash-Uncaged e sinapticamente-glutammato rilasciato a membrane astrocitici in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale durante salute e di malattia.
Introduction
Astrociti sono uno dei più abbondanti tipi di cellule nel cervello con morfologia a forma di stella e sporgenze sottili membrane che si estendono per tutta la neuropil e raggiungono limitrofi sinaptica contatti 1,2. Membrana cellulare Le astrociti 'è densamente ricco di glutammato molecole trasportatrici 3. In condizioni fisiologiche, trasportatori del glutammato legano rapidamente glutammato extracellulare a lato della membrana e trasferirlo al citoplasma cellulare. Così facendo, i trasportatori mantenere bassa la concentrazione basale di glutammato nello spazio extracellulare 4. Trasportatori del glutammato nei processi astrocitici sottili adiacenti eccitatori sinapsi sono in posizione ottimale per legare il glutammato rilasciato durante gli eventi sinaptici come si diffonde lontano dalla fessura sinaptica. In questo modo, i trasportatori limitano anche spillover glutammato verso e peri-regioni extra-sinaptici e sulla sinapsi vicine, riducendo la diffusione spaziale del segnale eccitatorios nel cervello 5-7.
Trasporto di glutammato è un processo elettrogenico stechiometricamente accoppiato al movimento di 3 Na + e 1 H + lungo il loro gradiente elettrochimico e alla contro-trasporto di K + 1 8. Trasporto di glutammato è associata con (ma non stechiometricamente accoppiata a) una conduttanza anionica permeabile SCN – (tiocianato)> NO 3 – (nitrato) ≈ ClO 4 – (perclorato)> I -> Br -> Cl -> F -, non a CH 3 SO 3 – (metano sulfonato) e C 6 H 11 O 7 – (gluconato) 9-11. Entrambe le correnti (stechiometrico e non stechiometrico) possono essere registrati mediante l'ottenimento di cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti, identificati visivamente sotto illuminazione Dodt o infrarossi contrasto di interferenza differenziale (IR-DIC) in acutposta del cervello fette 12. La componente stechiometrica della corrente associata trasporto di glutammato attraverso la membrana può essere isolato utilizzando CH 3 SO 3 -, o H 11 O 7 C 6 – soluzioni intracellulari based e può essere evocato dal glutammato flash-uncaging sugli astrociti 13,14, o attivando il rilascio di glutammato da sinapsi vicine, sia elettricamente 12 o con un controllo optogenetic mirato.
L'andamento temporale della componente stechiometrica della corrente trasportatore è modellato dalla durata del profilo di concentrazione glutammato in astrociti membrane (cioè clearance della glutammato), la cinetica di trasportatori del glutammato, le proprietà di membrana passivi di astrociti, e durante stimolazioni sinaptiche, dal sincronicità del rilascio di glutammato attraverso le sinapsi attivate 13. Qui si descrive in dettaglio: (1) un appr sperimentaleoach di isolare la componente stechiometrica delle correnti trasportatore del glutammato da cellule intere registrazioni di patch-clamp da astrociti utilizzando acute del mouse fettine di ippocampo come esempio la preparazione sperimentale, (2) un approccio analitico per ricavare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato da queste registrazioni 13, 14. Questi metodi possono essere usati per registrare e analizzare le correnti trasportatore del glutammato dagli astrociti in qualsiasi regione del sistema nervoso centrale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui si descrive un approccio sperimentale per ottenere registrazioni elettrofisiologiche da astrociti, un protocollo analitico per isolare le correnti trasportatore del glutammato negli astrociti e un metodo matematico per ricavare l'andamento nel tempo della clearance di glutammato dalle correnti transporter astrociti.
Il successo della analisi si basa sulla capacità di ottenere alta qualità registrazioni di patch clamp dagli astrociti e sulla precisione dei algoritmi di adattamento u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke del programma di ricerca intramurale (NS002986). Come ha scritto il manoscritto e implementato l'analisi di deconvoluzione. JSD ha sviluppato la versione iniziale dell'analisi deconvoluzione e commentato il testo.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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