Derivado de la evolución temporal de la Liquidación glutamato con un análisis de deconvolución de Corrientes Transporter astrocíticos
Summary
Se describe un método analítico para estimar la vida útil de glutamato en las membranas de los astrocitos a partir de grabaciones electrofisiológicas de las corrientes de transportador de glutamato en astrocitos.
Abstract
La mayor densidad de transportadores de glutamato en el cerebro se encuentra en astrocitos. Transportadores de glutamato par el movimiento de glutamato a través de la membrana con el co-transporte de Na + y 3 1 H + y el contador-transporte de K + 1. La corriente estequiométrica generada por el proceso de transporte se puede controlar con su conjunto de células patch-clamp grabaciones de astrocitos. El curso temporal de la corriente registrada está conformado por el transcurso de tiempo del perfil de glutamato concentración a la que están expuestos los astrocitos, la cinética de los transportadores de glutamato, y las propiedades electrotonic pasivos de membranas astrocíticos. Aquí se describen los métodos experimentales y analíticos que se pueden utilizar para registrar las corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y aislar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de todos los otros factores que dan forma a la forma de onda de las corrientes transportador astrocíticos. Los métodos descritos aquí pueden ser utilizados para estimar la vida útil of flash uncaged y glutamato liberado sinápticamente en membranas astrocíticos en cualquier región del sistema nervioso central durante la salud y la enfermedad.
Introduction
Los astrocitos son uno de los tipos de células más abundantes en el cerebro con morfología en forma de estrella y salientes de membrana fina que se extienden a lo largo de la neuropilo y llegan a la vecina contactos sináptica 1,2. Membrana celular Los astrocitos está densamente llena de moléculas transportadoras de glutamato 3. En condiciones fisiológicas, los transportadores de glutamato se unen rápidamente glutamato en el lado extracelular de la membrana y lo transfieren al citoplasma de la célula. Al hacerlo, los transportadores mantienen baja la concentración basal de glutamato en el espacio extracelular 4. Transportadores de glutamato en los procesos astrocíticos finas adyacentes a las sinapsis excitatoria están en una posición ideal para unirse glutamato liberado durante los eventos sinápticas como se difunde lejos de la hendidura sináptica. Al hacer esto, los transportadores de glutamato también limitan desbordamiento hacia peri-y extra-regiones sinápticas y en las sinapsis vecinas, la reducción de la propagación espacial de la señal excitadoras en el cerebro 5-7.
Transporte de glutamato es un proceso de electrogénico estequiométricamente acoplado al movimiento de 3 Na + y 1 + H a lo largo de su gradiente electroquímico y para la lucha contra el transporte de K + 8 1. Transporte de glutamato se asocia con (pero no junto estequiométricamente a) la conductancia aniónico permeable a SCN – (tiocianato)> NO 3 – (nitrato) ≈ ClO 4 – (perclorato)> I -> Br -> Cl -> F -, no a CH 3 SO 3 – (metano sulfonato) y C 6 H 11 O 7 – (gluconato) 9-11. Ambas corrientes (estequiométricas y no estequiométricas) se pueden grabar mediante la obtención de patch-clamp grabaciones de células enteras a partir de astrocitos, que se identifican visualmente bajo Dodt iluminación o diferencial de infrarrojos contraste de interferencia (IR-DIC) en acute rodajas de cerebro 12. El componente estequiométrica de la corriente asociada con el transporte de glutamato a través de la membrana se puede aislar mediante el uso de CH 3 SO 3 -, o C 6 H 11 O 7 – intracelulares basados en soluciones y puede ser evocada por el glutamato flash uncaging en astrocitos 13,14, o mediante la activación de la liberación de glutamato de las sinapsis vecinas, ya sea eléctricamente 12 o con un control optogenético específica.
El curso temporal de la componente de la corriente estequiométrica de transportador está formada por el curso de la vida del perfil de la concentración de glutamato en las membranas astrocíticos (por ejemplo, aclaramiento glutamato), la cinética de los transportadores de glutamato, las propiedades de la membrana pasivos de los astrocitos, y durante estimulaciones sinápticas, por la sincronía de la liberación de glutamato en las sinapsis activadas 13. A continuación se describe con todo detalle: (1) una ca experimentaloach para aislar el componente estequiométrica de corrientes de transportador de glutamato de su conjunto de células patch-clamp grabaciones de astrocitos utilizando rodajas de hipocampo de ratón agudos como una preparación experimental ejemplo; (2) un enfoque analítico para derivar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de estas grabaciones 13, 14. Estos métodos se pueden utilizar para registrar y analizar las corrientes de transportador de glutamato a partir de astrocitos en cualquier región del sistema nervioso central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un enfoque experimental para obtener los registros electrofisiológicos a partir de astrocitos, un protocolo de análisis para aislar corrientes transportador de glutamato en los astrocitos y un método matemático para derivar el curso del tiempo de aclaramiento de glutamato de las corrientes transportador astrocíticos.
El éxito del análisis se basa en la capacidad de obtener alta calidad patch clamp grabaciones a partir de astrocitos y en la exactitud de los algoritmos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Programa de Investigación Intramural Stroke (NS002986). Como escribió el manuscrito y aplicado el análisis de deconvolución. JSD desarrolló la primera versión del análisis de deconvolución y comentarios sobre el texto.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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