Summary

Количественный Анализ сотового мигрантах мышиных кишечных нейронных прародителей

Published: September 18, 2013
doi:

Summary

Мы представляем Экс Vivo клеточную миграцию анализа, который позволяет точное количественное определение кишечной нервной миграции гребень клеток потенциала в присутствии различных факторов роста.

Abstract

Клетки нервного гребня (NCC) являются временными и мультипотентны клеточная популяция, которая происходит от дорсальной части нервной трубки и мигрирует широко во всех развивающихся эмбрионов позвоночных. В дополнение к предоставлению периферийные глии и нейронов, NCC генерировать меланоциты, а также большую часть черепно-лицевого скелета. NCC миграция и дифференциация контролируется сочетанием их осевой происхождения вдоль нервной трубки и степень их подверженности региональном различных внеклеточных сигналов. Такой вклад внеклеточных лигандов особенно очевидно во время формирования кишечной нервной системы (ENS), сложной взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, что локально управляет (среди прочего) движения кишечника мышц и моторики кишечника. Большая часть ENS происходит от малого начального пула NCC, что предпринять долгое путешествие, чтобы колонизировать – в ростральнее хвостового моды – по всей длине предполагаемого кишечнике. Среди нескольких сигнальных путей, известныхвлиять кишечно NCC колонизации, GDNF / сигнализации РЭТ признан самым важным. Действительно, пространственно-временной контролируется секреция РЭТ лиганда GDNF в кишечнике мезенхимы является главным ответственным за привлечение и руководством RET-выражения кишечной NCC к и в эмбриональной кишки. Здесь мы описываем экс виво анализа миграции клеток, что делает использование трансгенной линии мышей, обладающего флуоресцентно меченого NCC, которая позволяет точную количественную оценку кишечной NCC миграционного потенциала в присутствии различных факторов роста, в том числе GDNF.

Introduction

Клетки нервного гребня (NCC) являются переходным типом клеток уникальным для позвоночных, которая формирует множество производных во время развития эмбриона. Это популяция клеток возникает на границе нервной пластинки, рядом с не-нейронных эктодермы 1. Во время нейруляции, изгиб нервной пластинки мест NCC вдоль верхнего края формирующегося нервной трубки. Затем НКК пройти переход эпителиально-мезенхимальных, разделения и миграции от нервной трубки. NCC колонизируют различные эмбриональные структуры, в том числе желудочно-кишечного тракта, где они образуют весь кишечно нервную систему (ENS), взаимосвязанной сети нейронной ганглиев, встроенного в стенку кишечника. Совсем недавно, отзывы 2,3, многие гены были вовлечены в разработку этой сложной структуры.

Большую часть ENS происходит от небольшой пул NCC происходящих из блуждающего нервной трубки (т.е. вокруг предполагаемой границы заднего мозга / спинного мозга) 4.Эти нервные клетки-предшественники достичь передней кишки вокруг эмбриональный день (е) 9,0 у мышей, а затем мигрируют каудально в кишечнике мезенхимы до примерно e15.0 не колонизировать весь эмбриональных кишечник. Несовершеннолетний подмножество толстой нейронных клеток-предшественников также обеспечивается сакральной NCC, который вторгнуться заднюю кишку в противоположном направлении до слепой кишки 4. Оба блуждающего и крестцового NCC требуют несколько миграция-, нераспространения, выживание-и дифференциация способствующих сигналы, чтобы обеспечить полное формирование ENS. В связи с этим, модели животных – особенно генетически модифицированные мыши – играют важную роль в выявлении нескольких существенных внеклеточных лигандов: GDNF (глиальных клеток нейротрофический фактор), эндотелина-3, нейротрофин-3, БМП (костные морфогенетические белки), Netrin , а также Соник и индийская Ежик (Тсс и Ihh) 5-10. Из них GDNF сигнализации через трансмембранный рецептор RET тирозинкиназы (переставить во трансфекции) признан йэ наиболее важным путем для привлечения и руководством НКК в и в эмбриональной кишки. GDNF секретируется кишечника мезенхимы и образует пространственно-временной контролируемый rosrrocaudal градиент, непосредственно chemoattractive к кишечной NCC, которые выражают РЭТ 11,12.

Среди других функций, ЭНС регулирует движение в желудочно-кишечном тракте через его взаимодействие с гладкой мускулатуры в стенке кишечника. Отсутствие нервной ганглиев в концевой области результатов кишечника при болезни Гиршпрунга: тоническое сокращение пораженного сегмента приводит к закупорке, вверх по течению накопления сброженного материала и массивной живота кишки и брюшной полости. Болезнь Гиршпрунга происходит примерно один из 5000 живорожденных. Ростро-каудальном миграция картина кишечной NCC, как полагают, является основным фактором, способствующим этиологии болезни Гиршпрунга. Толстой кишки, удалена от источника миграции NCC и последнюю часть бOwel подвергшихся колонизации, является наиболее восприимчивы к дефектам в формировании ENS. В соответствии с его решающую роль в кишечной миграции NCC, нарушение GDNF / RET сигнализации является основным известным генетическая причина болезни Гиршпрунга 13.

Чтобы лучше изучить NCC и развитие ENS, мы получили трансгенной линии мыши – по имени Gata4p [5kb]-GFP 14 – в которых миграционный NCC помечены зеленого флуоресцентного белка (GFP). Мы рядом усовершенствовал Экс Vivo миграции клеток анализа, адаптированный из опубликованных работ других групп 11,12,15, что теперь позволяет точное количественное определение кишечной NCC миграционного потенциала в присутствии различных факторов роста, таких как GDNF.

Protocol

Заявление Этика Опыты с мышами проводились следующие Канадского совета руководящих принципов по уходу за животными для ухода и манипуляции животных, используемых в медицинских исследованиях. Протоколы с участием манипуляции животных были утверждены комитетом институ?…

Representative Results

Следующие результаты являются репрезентативными что могут быть получены с методикой, описанной здесь (рис. 1). Использование факторов роста (т.е. GDNF) стимулирует миграцию GFP-экспрессирующих кишечно NCC из кишечника эксплантата и в гель коллагена (рис. 2). Хотя некотор…

Discussion

Мы покажем, как наш бывший естественных техника культура эксплант можно использовать для точного количественного кишечно NCC миграционный потенциал в присутствии GDNF. Такое точное количественное значительно облегчается с помощью 200 мкм-толстые секции Vibratome кишки вместо большие ку?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Дениса Флипо для обработки и анализа изображений советом, и Дэвид У. Silversides в лаборатории которого был создан Gata4p [5kb]-GFP мыши линии. Исследования в лаборатории Пилон финансируется CIHR, NSERC, FRQS и FRQNT.

Materials

DMEM powder Wisent 219-010-XK
NaHCO3 Bioshop SOB999 Biotechnology grade
Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) EMD Millipore SCGP00525
Penicilin-Streptomycin solution, 100x Wisent 450-201-EL
Fetal bovine serum Wisent 095-150 High quality grade
Collagen I BD biosciences 354236
NaOH Bioshop SHY700 Diluted from 10 N stock then sterile-filtered
GDNF Cedarlane CLCYT305
Falcon 24-well Plate BD biosciences 353047
Dissecting scissors Fisher Scientific 089515
Glass Petri dish VWR 89000-306
PBS Sigma P5493 Cell culture grade
Dissecting microscope Leica M125
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20
Agarose Bioshop AGA001 Biotechnology grade
Surgical blade Feather 21
All Purpose Instant Krazy Glue Pen Krazy Glue KG824
HM 650V Vibrating-Blade Microtome Thermo Scientific 920110
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
DAPI Sigma-Aldrich D9564

References

  1. Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
  2. Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
  3. Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
  4. Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
  5. Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
  6. Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
  7. Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
  8. Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
  9. Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
  10. Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
  11. Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
  12. Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
  13. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  14. Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
  15. Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
  16. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  18. Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).

Play Video

Cite This Article
Bergeron, K., Cardinal, T., Pilon, N. A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors. J. Vis. Exp. (79), e50709, doi:10.3791/50709 (2013).

View Video