Assay נדידת תאים כמותיות לMurine אבות עצביים enteric
Summary
אנו מציגים vivo לשעבר assay נדידת תאים המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל נדידת תאי רכס העצבי enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים.
Abstract
תאי רכס עצביים (NCC) הם אוכלוסיית תאים חולפת וmultipotent שמקורו בצינור העצבי הגבי ונודדת בהרחבה לאורך כל עובר חוליות המתפתחת. בנוסף לאספקת גליה ותאי עצב היקפיים, NCC ליצור מלנוציטים כמו גם רוב שלד קרניו-פנים. הגירת NCC והבידול נשלט על ידי שילוב של מוצא הצירי שלהם יחד בצינור העצבי ואת החשיפה שלהם לאותות תאיים אזורי שונים. תרומה כזו של ligands תאי באה לידי ביטוי במיוחד בתקופת היווצרותה של מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מורכבת ביניהם של הגרעינים עצביים השולטת באופן מקומי (בין השאר) תנועת שרירים בטן ואת תנועתיות מעיים. רוב ENS נגזר מברכה ראשונית קטנה של NCC שמתחייב למסע ארוך על מנת ליישב – במקורי לאופנה הזנב – לכל אורכו של המעי הפוטנציאלי. בין כמה מסלולי איתות ידועיםלהשפיע קולוניזציה NCC enteric, GDNF / איתות RET מוכרת כחשוב ביותר. ואכן, הפרשת spatiotemporally המבוקר של ליגנד RET GDNF ידי mesenchyme הבטן היא בעיקר אחראית למשיכה והדרכתו של NCC enteric-להביע RET ולבתוך הבטן העוברית. כאן, אנו מתארים vivo לשעבר assay נדידת תאים, מה שהופך את שימוש בקו עכבר מהונדס בעלי NCC שכותרתו fluorescently, המאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כולל GDNF.
Introduction
תאי רכס עצביים (NCC) הם סוג תא חולף ייחודי לבעלי חוליות שמהווה נגזרים רבים במהלך ההתפתחות העובר. אוכלוסיית תא זו מתעוררת בגבול של הצלחת העצבית, סמוך להאאקטודרם אינו עצבי 1. במהלך neurulation, כיפוף של מקומות צלחת העצביים NCC לאורך קצה הגב של הצינור העצבי ויוצרים. NCC אז לעבור מעבר אפיתל-mesenchymal, הפרדה ונודדות הרחק בצינור העצבי. NCC ליישב מבנים עובריים שונים, כולל מערכת העיכול שבו הם יוצרים את כל מערכת העצבים enteric (ENS), רשת מקושרת ביניהם של הגרעינים עצביים מוטבעת בדופן המעי. כפי שנסקר 2,3 לאחרונה, גנים רבים היו מעורבים בפיתוח של המבנה המורכב הזה.
רוב ENS נגזר מברכה קטנה של מקור NCC מצינור מחנק העצבי (כלומר סביב הגבול למוח האחורי / חוט השדרה הפוטנציאלי) 4.אבות עצביים אלה מגיעים למעי הקדמי סביב היום העוברי (ה) 9.0 בעכברים ולאחר מכן להעביר caudally בתוך mesenchyme הבטן עד כ e15.0 ליישב את המעיים העובריים כולה. קבוצת משנה של קטין אבות עצביים במעי הגס הוא גם סיפקה ידי NCC עצם העצה, שיפלוש הבטן האחורית בכיוון ההפוך עד cecum 4. NCC שני מחנק ועצם העצה דורש מספר רב של הגירה, שגשוג, הישרדות ורמזי קידום בידול כדי להבטיח היווצרות של ENS מלא. בהקשר זה, מודלים של בעלי חיים – עכברים מהונדסים גנטי במיוחד – כבר סייעו בזיהוי של מספר ligands תאי החיוני: GDNF (גורם נוירוטרופי שמקורן בתאים גליה),,, (חלבוני morphogenic עצם) BMPs אנדותלין-3 neurotrophin-3, Netrin , כמו גם סוניק וההודי קיפוד (ששש וIHH) 5-10. מתוכם, GDNF איתות דרך RET טירוזין קינאז רצפטור הטרנסממברני (Rearranged במהלך transfection) מוכר כהדואר נתיב הקריטי ביותר לאטרקציה והדרכתו של NCC ולבתוך הבטן העוברית. GDNF מופרש על ידי mesenchyme המעיים ויוצר שיפוע rosrrocaudal spatiotemporally מבוקר שהוא ישירות chemoattractive לNCC enteric, המבטא RET 11,12.
בין פונקציות אחרות, ENS מסדיר תנועה בתוך מערכת העיכול דרך האינטראקציה שלו עם שריר חלק שבדופן המעי. היעדרם של הגרעינים עצביים באזור הטרמינל של תוצאות המעי במחלת הירשפרונג: התכווצות טוניק של המגזר המושפע מוביל לחסימה, הצטברות במעלה הזרם של חומר מתעכל והתנפחות מסיבית של המעי והבטן. מחלת הירשפרונג מתרחשת כ אחד 5,000 לידה חי. דפוס הגירת rostro-הזנב של NCC enteric הוא האמין להיות הגורם העיקרי התורמים לאטיולוגיה של מחלת הירשפרונג. המעי הגס, הרחוק ביותר מהמקור הנודד NCC והחלק האחרון של bowel שאפשר לכבוש, הוא רגיש ביותר לפגמים בהיווצרות ENS. בהתאם לתפקיד המכריע שלה בהגירה NCC enteric, שיבוש איתות GDNF / RET הוא הגורם הגנטי הידוע העיקרי של מחלת הירשפרונג 13.
כדי ללמוד טוב יותר NCC ופיתוח ENS, אנחנו שנוצרנו קו מהונדס עכבר – בשם Gata4p [5KB]-GFP 14 – בי NCC נדידה מסומנים עם חלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP). בשלב הבא אנו שיכללתי לשעבר assay vivo נדידת תאים, מותאם מעבודה שפורסמה על ידי קבוצות אחרות 11,12,15, שכעת מאפשר כימות מדויק של פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות של גורמי גדילה שונים, כגון GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מראים כיצד vivo לשעבר טכניקת תרבות explant שלנו יכולה לשמש כדי לכמת באופן מדויק את פוטנציאל הגירת NCC enteric בנוכחות GDNF. כימות מדויק כזה הוא הקל מאוד על ידי שימוש 200 חלקי מעיים vibratome מיקרומטר עבים במקום חתיכות גדולות של גודל משוער, כפי שתואר 11,12,15 בעבר. ואכן, זה מאפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים דניס Flipo עצה עיבוד תמונה וניתוח, ודוד וו Silversides במעבדה שלו היה נוצר קו עכבר Gata4p [5KB]-GFP. מחקר במעבדה פילון ממומן על ידי CIHR, NSERC, FRQS וFRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
