Een kwantitatieve cel-migratie test voor Muriene Enterisch neurale voorlopercellen
Summary
We presenteren een ex vivo celmigratie analyse die exacte kwantificering van enterische neurale celmigratie potentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren maakt.
Abstract
Neurale cellen (NCC) is een voorbijgaande en multipotent celpopulatie die afkomstig is van de dorsale neurale buis en migreert intensief rond de ontwikkeling van gewervelde embryo. Naast het leveren van perifere glia en neuronen, NCC genereren melanocyten evenals de meeste van de craniofaciale skelet. NCC migratie en differentiatie wordt door een combinatie van de axiale oorsprong langs de neurale buis en hun blootstelling aan regionaal verschillende extracellulaire signalen. Een dergelijke bijdrage van extracellulaire liganden is vooral duidelijk tijdens de vorming van het enterische zenuwstelsel (ENS), een complex netwerk van onderling verbonden neurale ganglia die lokaal regelt (onder andere) gut spierbewegingen en darmmotiliteit. Het merendeel van de ENS is afgeleid van een kleine initiële pool van NCC die een lange reis ondernemen om te koloniseren – in een rostrale om caudale mode – de gehele lengte van de aspirant-darm. Onder verschillende signaalwegen bekend bijbeïnvloeden enterische NCC kolonisatie, wordt GDNF / RET signalering erkend als de belangrijkste. Inderdaad, spatiotemporeel gecontroleerde afscheiding van de RET ligand GDNF door de darm mesenchym is voornamelijk verantwoordelijk voor het aantrekken en begeleiden van-RET uitdrukken enterische NCC naar en binnen de embryonale darm. Hier beschrijven we een ex vivo celmigratie assay gebruikmakend van een transgene muis lijn bezit fluorescerend gemerkte NCC, die nauwkeurige kwantificering van enterische NCC migratiepotentieel in aanwezigheid van verschillende groeifactoren, waaronder GDNF maakt.
Introduction
Neurale cellen (NCC) is een voorbijgaande celtype uniek is voor gewervelde dieren dat veel derivaten maakt tijdens de ontwikkeling van het embryo. Deze celpopulatie ontstaat op de grens van de neurale plaat, naast niet-neurale ectoderm 1. Tijdens neurulatie, buigen van de neurale plaat plaatsen NCC langs de dorsale rand van de vorm neurale buis. NCC ondergaan dan een epitheliale-mesenchymale transitie, scheiden en migreren weg van de neurale buis. NCC koloniseren verschillende embryonale structuren, waaronder het spijsverteringskanaal waar zij vormen de gehele enterische zenuwstelsel (ENS), een onderling verbonden netwerk van neurale ganglia ingebed in de darmwand. Zoals onlangs beoordeeld 2,3, hebben vele genen betrokken bij de ontwikkeling van deze ingewikkelde structuur.
De meeste ENS is afgeleid van een kleine pool van NCC afkomstig van de vagale neurale buis (dwz in de toekomstige achterhersenen / ruggenmerg grens) 4.Deze neurale voorlopercellen bereikt de voordarm rond embryonale dag (e) 9.0 in muizen en vervolgens migreren caudaal in de darm mesenchym tot ongeveer e15.0 om de hele embryonale darmen koloniseren. Een kleine subset van colon neurale voorlopercellen verschaft ook sacrale NCC, die de achterste darm tot de blindedarm 4 binnendringen in de tegenovergestelde richting. Zowel de vagale en sacrale NCC vereisen meerdere migratie-, proliferatie-, survival-en-differentiatie bevorderen signalen om volledige vorming van de ENS zorgen. In dit verband diermodellen – vooral genetisch gemodificeerde muizen – zijn geweest bij de identificatie van verschillende essentiële extracellulaire liganden opgeleverd GDNF (glial cel-afgeleide neurotrofe factor), endotheline-3, neurotrofine-3, BMP (bot morfogenetische eiwitten), Netrin , evenals Sonic en Indiase Hedgehog (Shh en Ihh) 5-10. Van deze, GDNF signalering door de tyrosine kinase transmembraanreceptor RET (Rearranged tijdens transfectie) wordt erkend als ee meest kritieke pad voor het aantrekken en begeleiden van NCC naar en binnen de embryonale darm. GDNF wordt afgescheiden door de darm mesenchym en vormt een spatiotemporeel gecontroleerde rosrrocaudal gradiënt die direct chemoattractive enterische NCC, die RET 11,12 expressie.
Onder andere functies, de ENS regelt verkeer binnen het spijsverteringskanaal door de interactie met gladde spier in de darmwand. Afwezigheid van neurale ganglia in het terminale gebied van de darm leidt tot ziekte van Hirschsprung: tonische contractie van het aangetaste segment leidt tot verstopping stroomopwaarts accumulatie van verteerd materiaal en massale uitzetting van de darm en buik. Ziekte van Hirschsprung komt ongeveer een op 5000 levende geboorten. De rostro-caudale migratiepatroon van enterische NCC wordt beschouwd als de belangrijkste factor die bijdraagt aan de etiologie van de ziekte van Hirschsprung zijn. De dikke darm, het verst van de bron van migrerende NCC en laatste portie bOwel te worden gekoloniseerd, is het meest gevoelig voor defecten in ENS formatie. In overeenstemming met haar cruciale rol in enterische NCC migratie, verstoring van GDNF / RET signalering is de belangrijkste bekende genetische oorzaak van de ziekte van Hirschsprung 13.
Om beter te bestuderen NCC en ENS ontwikkeling genereerden wij een transgene muis lijn – vernoemd Gata4p [5kb]-GFP 14 – waarin trekkende NCC zijn gelabeld met Green Fluorescent Protein (GFP). We vervolgens geperfectioneerd een ex vivo cel migratie assay, aangepast van gepubliceerd werk van andere groepen 11,12,15, die nu zorgt voor een precieze kwantificering van enterische NCC migratie potentieel in de aanwezigheid van verschillende groeifactoren, zoals GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
We tonen hoe onze ex vivo explantaatkweek techniek kan worden gebruikt om enterische NCC migratiepotentieel nauwkeurig te kwantificeren in aanwezigheid van GDNF. Dergelijke precieze kwantificering wordt sterk vergemakkelijkt door 200 urn dikke darm vibratome gedeelten plaats van grote stukken benaderende afmetingen, zoals eerder beschreven 11,12,15. Inderdaad, deze kunnen we met een redelijk aantal cellen in een zeer reproduceerbare instelling. Opmerkelijk, de uniforme verdeling van fluorescerende en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Denis Flipo voor beeldverwerking en analyse-advies, en David W. Silversides in wiens laboratorium het Gata4p [5kb]-GFP muis lijn werd gegenereerd. Onderzoek in het laboratorium Pilon wordt gefinancierd door CIHR, NSERC, FRQS en FRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
