En kvantitativ Cell Migration analysen for Murine resistente Neural stamceller
Summary
Vi presenterer en ex vivo-cellemigrering assay som tillater presis kvantifisering av enterisk neural crest celle migrasjon potensiale i nærvær av forskjellige vekstfaktorer.
Abstract
Neural crest cellene (NCC) er en forbigående og multipotent cellepopulasjon som stammer fra rygg nevralrøret og vandrer mye i hele utviklings virveldyr embryo. I tillegg til å gi perifere gliaceller og nevroner, NCC generere melanocytter samt det meste av cranio-ansikts skjelett. NCC migrasjon og differensiering er kontrollert av en kombinasjon av deres aksial opprinnelse langs nevralrøret og deres eksponering for regionalt distinkte ekstracellulære signaler. Slike er bidraget av ekstracellulære ligander spesielt tydelig under dannelse av den enterisk nervesystem (ENS), et komplekst sammenvevd nettverk av nervegangliene som lokalt styrer (blant annet) gut muskelbevegelse og intestinal motilitet. Mesteparten av ENS er avledet fra en liten innledende pool av NCC at foreta en lang reise for å kolonisere – i et rostral til caudal mote – hele lengden av den potensielle tarmen. Blant flere signalveier er kjent for åpåvirke enteric NCC kolonisering, er GDNF / RET signaleanerkjent som den viktigste. Faktisk er spatiotemporally kontrollert sekresjon av RET ligand GDNF av tarmen mesenchyme hovedsakelig ansvarlig for tiltrekning og veiledning av RET-uttrykke enteric NCC til og innenfor den embryonale gut. Her beskriver vi en ex vivo-cellemigrering assay, som gjør bruk av en transgen muselinje som innehar fluorescensmerkede NCC, som tillater presis kvantifisering av enteriske NCC migrasjon potensiale i nærvær av forskjellige vekstfaktorer, inkludert GDNF.
Introduction
Neural crest cellene (NCC) er en forbigående celletype som er unik for virveldyr som danner mange derivater under embryoutvikling. Denne cellen befolkningen oppstår på grensen av det nevrale plate, som grenser til ikke-nevrale ektoderm en. Under neurulation, bøying av neural plate steder NCC langs ryggkanten danner neural røret. NCC deretter gjennomgå en epitelial-mesenkymale overgang, segregerende og migrere bort fra nevralrøret. NCC kolonisere forskjellige embryonale strukturer, inkludert i fordøyelseskanalen, hvor de danner en hel enterisk nervesystem (ENS), et sammenkoplet nettverk av nervegangliene innleiret i tarmveggen. Som nylig anmeldt 2,3, har mange gener er involvert i utviklingen av dette intrikate struktur.
Mesteparten av ENS er avledet fra en liten mengde av NCC stammer fra neural vagal-røret (dvs. rundt den potensielle hindbrain / ryggmarg grense) 4..Disse nevrale stamceller nå forutgående rundt embryonale dag (e) 9,0 hos mus, og deretter vandrer caudally i tarmen mesenchyme inntil ca e15.0 å kolonisere hele embryonale tarmen. En liten undergruppe av colonic nevrale stamceller er også forsynt med sakral NCC, som invaderer den bakre tarm i motsatt retning opp til cecum 4.. Både vagal og sakrale NCC krever flere migrasjon-, spredning-, overlevelses-og differensieringsfremmende signaler for å sikre komplett dannelsen av ENS. I denne forbindelse, dyremodeller – spesielt genmodifiserte muse – har vært medvirkende i identifisering av flere essensielle ekstracellulære ligander: GDNF (glial celle-avledet neurotrophic factor), Endotelin-3, neurotrophin-3, BMP (benmorfogent proteiner), Netrin , samt Sonic og indiske Hedgehog (Shh og IHH) 5-10. Av disse er GDNF signalering gjennom tyrosin kinase transmembrane reseptor RET (Rearranged under transfeksjon) anerkjent som the mest kritisk vei for tiltrekning og veiledning av NCC til og i den embryonale gut. GDNF skilles ut av tarmen mesenchyme og danner en spatiotemporally kontrollert rosrrocaudal gradient som er direkte chemoattractive til ente NCC, som uttrykker RET 11,12.
Blant andre funksjoner, ENS regulerer bevegelsen i fordøyelseskanalen gjennom dets interaksjon med glatt muskulatur i tarmveggen. Fravær av nevrale ganglier i terminalen regionen i tarmen resulterer i Hirschsprung sykdom: tonic sammentrekning av de berørte segmentet fører til blokkering, oppstrøms opphopning av fordøyd materiale og massive oppblåsthet i tarmen og magen. Hirschsprung sykdom oppstår omtrent ett i 5000 levendefødte. Den rostro-caudal vandringsmønster av ente NCC antas å være den viktigste medvirkende faktor til etiologi av Hirschsprung sykdom. Tykktarmen, lengst fra kilden til å migrere NCC og siste del av bOwel å bli kolonisert, er mest utsatt for feil i ENS formasjon. I samsvar med sin avgjørende rolle i ente NCC migrasjon, er forstyrrelse av GDNF / RET signale den viktigste kjente genetiske årsaken til Hirschsprung sykdom 13.
For bedre å studere NCC og ENS utvikling, genererte vi en transgen muselinje – oppkalt Gata4p [5kb]-GFP 14 – der vandrende NCC er merket med grønt fluorescerende protein (GFP). Vi neste perfeksjonert en ex vivo-cellemigrering analyse tilpasset fra publiserte arbeide av andre grupper 11,12,15, som nå tillater presis kvantifisering av enteriske NCC migrasjon potensiale i nærvær av forskjellige vekstfaktorer, slik som GDNF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi viser hvordan vår ex vivo eksplantering kultur teknikken kan brukes til nøyaktig å kvantifisere enteric NCC migrering potensiale i nærvær av GDNF. En slik presis kvantifisering, gjøres meget lettere ved hjelp av 200 mikrometer tykke vibratome gut seksjoner i stedet for store stykker av omtrentlig størrelse, som tidligere beskrevet 11,12,15. Faktisk gjør dette at vi å arbeide med et rimelig antall celler i en reproduserbar innstilling. Til opplysning, tillater ensartet fordeling av fluores…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Denis Flipo for bildebehandling og analyse råd, og David W. Silver i hvis laboratoriet Gata4p [5kb]-GFP mus linjen ble generert. Forskning i Pilon laboratoriet er finansiert av CIHR, NSERC, FRQS og FRQNT.
Materials
| DMEM powder | Wisent | 219-010-XK | |
| NaHCO3 | Bioshop | SOB999 | Biotechnology grade |
| Steriflip vacuum filtration system (0.22 micron) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicilin-Streptomycin solution, 100x | Wisent | 450-201-EL | |
| Fetal bovine serum | Wisent | 095-150 | High quality grade |
| Collagen I | BD biosciences | 354236 | |
| NaOH | Bioshop | SHY700 | Diluted from 10 N stock then sterile-filtered |
| GDNF | Cedarlane | CLCYT305 | |
| Falcon 24-well Plate | BD biosciences | 353047 | |
| Dissecting scissors | Fisher Scientific | 089515 | |
| Glass Petri dish | VWR | 89000-306 | |
| PBS | Sigma | P5493 | Cell culture grade |
| Dissecting microscope | Leica | M125 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Biotechnology grade |
| Surgical blade | Feather | 21 | |
| All Purpose Instant Krazy Glue Pen | Krazy Glue | KG824 | |
| HM 650V Vibrating-Blade Microtome | Thermo Scientific | 920110 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 |
References
- Bronner, M. E., Le Douarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: An overview. Dev. Biol. 366 (1), 2-9 (2012).
- Bergeron, K. F., Silversides, D. W., Pilon, N. The developmental genetics of Hirschsprung’s disease. Clin. Genet. 83 (1), 15-22 (2013).
- Obermayr, F., Hotta, R., Enomoto, H., Young, H. M. Development and developmental disorders of the enteric nervous system. Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 10 (1), 43-57 (2012).
- Sasselli, V., Pachnis, V., Bursn, A. J. The enteric nervous system. Dev. Biol. 366 (1), 64-73 (2012).
- Sanchez, M. P., Silos-Santiago, I., et al. Renal agenesis and the absence of enteric neurons in mice lacking GDNF. Nature. 382 (6586), 70-73 (1996).
- Baynash, A. G., Hosoda, K., et al. Interaction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell. 79 (7), 1277-1285 (1994).
- Chalazonitis, A., Pham, T. D., et al. Neurotrophin-3 is required for the survival-differentiation of subsets of developing enteric neurons. J. Neurosci. 21 (15), 5620-5636 (2001).
- Goldstein, A. M., Brewer, K. C., Doyle, A. M., Nagy, N., Roberts, D. J. BMP signaling is necessary for neural crest cell migration and ganglion formation in the enteric nervous system. Mech. Dev. 122 (6), 821-833 (2005).
- Jiang, Y., Liu, M. T., Gershon, M. D. Netrins and DCC in the guidance of migrating neural crest-derived cells in the developing bowel and pancreas. Dev. Biol. 258 (2), 364-384 (2003).
- Ramalho-Santos, M., Melton, D. A., McMahon, A. P. Hedgehog signals regulate multiple aspects of gastrointestinal development. Development. 127 (12), 2763-2772 (2000).
- Natarajan, D., Marcos-Gutierrez, C., Pachnis, V., de Graaf, E. Requirement of signaling by receptor tyrosine kinase RET for the directed migration of enteric nervous system progenitor cells during mammalian embryogenesis. Development. 129 (22), 5151-5160 (2002).
- Young, H. M., Hearn, C. J., et al. GDNF Is a chemoattractant for enteric neural cells. Dev. Biol. 229 (2), 503-516 (2001).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J. Med. Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Pilon, N., Raiwet, D., Viger, R. S., Silversides, D. W. Novel pre- and post-gastrulation expression of Gata4 within cells of the inner cell mass and migratory neural crest cells. Dev. Dyn. 237 (4), 1133-1143 (2008).
- Nagy, N., Goldstein, A. M. Endothelin-3 regulates neural crest cell proliferation and differentiation in the hindgut enteric nervous system. Dev. Biol. 293 (1), 203-217 (2006).
- Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersen, K., Behringer, R. . Manipulating the mouse embryo: a laboratory manual. , 209-250 (2003).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
- Byth, K. F., Thomas, A., et al. AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts. Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).
