Medlemmer af Burkholderia slægten er patogener af klinisk betydning. Vi beskriver en fremgangsmåde til den samlede bakterieprotein ekstraktion, ved hjælp af mekanisk sprængning og 2-D gelelektroforese til efterfølgende proteom analyse.
Undersøgelsen af de intracellulære proteinniveauer bakteriearter er af betydning for forståelsen af de patogene mekanismer af sygdomme forårsaget af disse organismer. Her beskriver vi en fremgangsmåde til proteinekstraktion fra Burkholderia arter baseret på mekanisk lysis ved hjælp af glasperler i nærvær af ethylendiamin-tetraeddikesyre og phenylmethylsulfonylfluorid i phosphatbufret saltvand. Denne metode kan bruges til forskellige Burkholderia arter for forskellige vækstbetingelser, og det er sandsynligt, egnet til brug i proteom studier af andre bakterier. Efter proteinekstraktion, er en to-dimensionel (2D) gelelektroforese proteomisk beskrevne teknik til at studere globale ændringer i proteomer af disse organismer. Denne metode består i adskillelse af proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimension, efterfulgt af adskillelse på basis af molekylvægtaf acrylamid gel elektroforese i den anden dimension. Visualisering af separerede proteiner udføres ved sølvfarvning.
Slægten Burkholderia omfatter mere end 62 arter, gram-negative organismer, der er isoleret fra en bred vifte af nicher, og det er opdelt i to hovedgrupper 1,2. Den første klynge omfatter mennesker, dyr og phytotrophic organismer, og de fleste undersøgelser har fokuseret på de patogene arter af denne gruppe på grund af deres kliniske betydning. De mest patogene medlemmer er B. pseudomallei og B. mallei (der forårsager melioidosis og snive henholdsvis) 3,4 og opportunistiske patogener (de 17 definerede arter af Burkholderia cepacia kompleks, BCC) 5, som forårsager sygdom hos cystisk fibrose (CF) og kronisk granulomatøs sygdom (CGD) 1.. Den anden klynge, med mere end 30 nonpathogenic arter inkluderer bakterier forbundet med planter eller med miljøet, og betragtes som potentielt gavnlig for værten 2..
Talrige komplikationer dukke op frabout bakteriel infektion med patogene medlemmer af Burkholderia slægten, såsom transmission af patogenet mellem patienter, spredning af sygdommen og fiasko behandling på grund af den iboende eller erhvervet resistens over for antibiotika gør hårdt for at udrydde i de fleste tilfælde 6-9. Derfor få en klarere forståelse af grundlaget for etablering af bakteriel infektion er afgørende for behandling af sygdomme forårsaget af disse organismer. For at få indblik i etableringen af infektion, er der behov for omfattende undersøgelser på de bakterielle komponenter, der er forbundet med patogenese. Undersøgelser med fokus på proteom analyse af Burkholderia organismer ved hjælp af proteom tilgange beskrevet proteiner, der har været impliceret i bakteriel patogenese samt ændringer i deres proteom profiler 10-16.
Proteinekstraktion metoder ved hjælp af lydbehandling og fryse-optøede cykler i lysis buffer indeholdende høj koncentration af urinstof, har thiourinstof i kombination med rengøringsmiddel og amfolytter blevet anvendt i Burkholderia proteom studier 10-13. Selv om urinstof er ganske effektiv til proteindenaturering, kan det oprette en ligevægt i vandig opløsning med ammonium-isocyanat, der kan reagere med amino-grupper, hvorved der dannes artefakter (carbamylering reaktion) 17. Derfor anbefales det, at bl.a. Carrier ampholytter, der fungerer som cyanat skraldemanden og undgå temperaturer over 37 ° C 17. For at forebygge enhver kemisk interferens lysisbuffer med protein kvantificering samme lysisbuffer kan anvendes til at generere standardkurven, således at prøverne og standarderne har samme baggrund 10. Andre metoder indebærer brug af alkaliske buffere og rengøringsmidler med varme inkubationsperioder 17,18, men disse forhold kan fremkalde ændringer i proteom og nogle rengøringsmidler er ikke kompatible med PRoteomics ansøgning, medmindre efterfølgende trin vaskemiddel fjernelse indgår 17,18.
Efter tilstrækkelig ekstraktion og kvantificering kan den globale protein udtryk enkelte protein blive undersøgt ved hjælp af proteom tilgange såsom todimensionale (2-D) gelelektroforese. Denne teknik blev først beskrevet af O'Farell 19 og består i adskillelse af proteiner i henhold til deres isoelektriske punkt ved isoelektrisk fokusering i den første dimension, og derefter i henhold til deres molekylvægt af acrylamid gel elektroforese i den anden dimension. På grund af sin opløsning og følsomhed, denne teknik er et kraftfuldt værktøj til analyse og påvisning af proteiner fra komplekse biologiske kilder 19,20. Denne adskillelse teknik er i øjeblikket tilgængelig i protein-centreret tilgange med den store fordel at løse protein isoformer forårsaget af posttranskriptionel modifikationer eller proteolytisk forarbejdning. Kvantitative ændringerkan påvises ved at sammenligne intensiteten af den tilsvarende stedet efter farvning af gelen 20. Imidlertid er denne teknik ikke egnet til identifikation af meget store proteiner, membranproteiner, yderst basiske og sure eller hydrofobe proteiner, og det er en noget besværlig og tidskrævende teknik 20. Nye peptid-centreret tilgang (ikke gel-baseret), der er mere robust og mål bliver tilgængelige og kan anvendes til kvantitativ sammenligning af differentielle mærkning med stabile isotoper metoder såsom cystein mærkning af isotop-kodede affinitet tagging (ICAT) 21, og aminogruppe mærkning af isotop tagging for relativ og absolut kvantificering (iTRAQ) 22. Anvendelsen af en enkelt proteomisk teknik kan give tilstrækkelige oplysninger, og derfor er det nødvendigt at anvende to komplementære proteom tilgange til de fleste fuldt ud at vurdere ændringer i proteomanalyse. Ikke desto mindre er 2-D gelelektroforese udbredte og kan rutinemæssigt anvendes til mængdertive ekspression af flere proteiner i forskellige organismer.
Her beskriver vi en hel-celle protein udvinding og 2-D gel elektroforese procedurerne for Burkholderia arter, der blev tilpasset og optimeret fra GE Healthcare 2-D elektroforese Principper og metoder Håndbog 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). Proteinet Ekstraktionen blev udført ved anvendelse af en perle beater med glasperler i nærvær af PBS indeholdende 5 mM EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) og 1 mM PMSF (phenylmethylsulfonylfluorid). Denne procedure giver mulighed for kvantificering af proteiner med minimal nedbrydning og er amendable for proteom tilgange som tidligere rapporteret 15,23,24. 2-D gelelektroforese blev udført under anvendelse af 24 cm lange immobiliserede pH 4-7 gradient og proteiner blev adskilt i overensstemmelse med deres isoelektriske punkt. Derefter proteiner blev separeret efter deres Molecular vægt ved SDS-polyacrylamidgel. Derudover beskrev vi en sølvfarvning fremgangsmåde til visualisering af spot proteiner og en sølvfarve metode, der er kompatible til massespektrometrianalyse. Sammen disse procedurer kan føre til identifikation af vigtige proteiner fra Burkholderia arter, som kan være involveret i patogenesen.
En fremgangsmåde til fremstilling proteiner er blevet beskrevet, der kan udtrække størstedelen af Burkholderia proteiner med god reproducerbarhed. Dette er påvist ved at opnå den samme protein profil fra to uafhængige præparater udføres i forskellige dage under anvendelse af samme bakterie-kultur dyrket i LB eller YEM bouillon, som vist i figur 1. Udvinding var effektiv for bakterier dyrket i flydende medier, men vi har testet denne metode for bakterier dyrket på plader. Denne metode b…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en studentship fra The University of British Columbia (BV) og tilskud fra cystisk fibrose Canada og canadiske Institutes of Health Research (til DPS). Vi takker Jacqueline Chung til den indledende forberedelse af protokoller.
Reagents | |||
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | Toxic, corrosive |
Acetone | Fisher | A18-1 | Flammable |
PBS Buffer | Bioscience | R028 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | BP118-500 | toxic |
Glass beads (0.1 mm) | BioSpec Products | 11079101 | |
Nalgene Oak Ridge Centrifuge tubes, polycarbonate (50 ml) | VWR | 21009-342 | |
MicroBCA protein extraction kit | Pierce | 23235 | |
Microcentrifuge Tubes 2.0 ml conical Screw cap Tubes with Cap and O-Ring | Fisher | 02-681-375 | |
2-D Clean-Up kit | GE Healthcare | 80-6484-51 | |
Urea | Invitrogen | 15505-050 | Irritant |
CHAPS | Amersham Biosciences | 17-1314-01 | |
Dithiothreitol (DTT) | MPBiomedical, LCC | 856126 | Irritant |
Immobiline DryStrips pH 4-7 24 cm | Amersham Biosciences | 176002-46 | |
Duracryl | Proteomic Solutions | 80-0148 | Very toxic, carcinogen |
Ammonium persulfate | Fisher | BP179-100 | Flammable, toxic, corrosive |
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Invitrogen | 15524-010 | Flammable |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Acute toxicity, flammable |
Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
Ethanol | Fisher | HC1100-1GL | Flammable, toxic |
Acetic acid | Fisher | A491-212 | Flammable, corrosive |
Glutaraldehyde | Fisher | G151-1 | Very toxic, corrosive, dangerous for the environment |
Potassium tetrathionate | Sigma | P2926 | Irritant |
Sodium acetate | EM Science | 7510 | |
Silver nitrate | Sigma | 209139 | Corrosive, dangerous for the environment |
Formaldehyde | Sigma | 252549 | Toxic |
Sodium thiosulfate | Sigma | S7026 | |
Tris Base | EMD | 9230 | |
Glycine | MPBiomedical, LCC | 808831 | |
Glycerol | MPBiomedical, LCC | 800688 | |
Methanol | Fisher | A412-4 | Flammable, toxic, health hazard |
Sodium carbonate anhydrous | EMD | SX0400-3 | Toxic |
Mineral oil | ACROS | 415080010 | |
Equipment | |||
JA-20 ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 334831 | |
Mini Beadbeater | Biospec Products | 3110BX | |
Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing System and accessories | GE Healthcare | 80-6505-03 | www.amershambiosciences.com |
Ettan DALT Large Vertical electrophoresis system | GE Healthcare | 80-6485-27 | www.amershambiosciences.com |