זיהוי מוטציות DNA בתאי גזע / אב המטוהר Hematopoietic
Summary
כאן אנו מתארים in vivo assay mutagenesis למספר קטן של תאי hematopoietic מטוהרים באמצעות מודל עכבר המהונדס לאצי. גן האצים יכול להיות מבודד כדי לקבוע את התדירות, מיקום והסוג של מוטציות DNA באופן ספונטני קם או לאחר החשיפה לgenotoxins.
Abstract
בשנים האחרונות, זה הפך להיות ברור כי חוסר יציבות גנומית קשור בחוזקה רבות הפרעות התפתחותיות, סרטן והזדקנות. בהתחשב בעובדה שתאי גזע אחראים להבטיח הומאוסטזיס רקמות ותיקון לאורך כל חיים, סביר לשער שהאוכלוסייה בתאי גזע הוא קריטית לשמירה על שלמות גנטית של רקמות. לכן, עניין משמעותי שקם בהערכת ההשפעה של גורמים במשק וסביבתי על שלמות הגנום בתאי גזע וצאצאיהם, במטרה להבין את האטיולוגיה של מחלות בתאי גזע מבוססות.
עכברים הטרנסגניים לאצי לשאת וקטור הפאג λ ההשבה קידוד מערכת הכתב לאצי, שבו הגן לאצי משמש ככתב המוטציה. התוצאה של גן שעבר מוטציה לאצי היא הייצור של β-galactosidase המסלק את מצע chromogenic, הפיכתו הכחולה. מערכת כתב האצים היא נשאתיn כל התאים, כולל תאי גזע / אב והוא יכול בקלות להיות התאושש ונהג להדביק לאחר מכן א ' coli. לאחר דוגרים ה נגועה coli על agarose המכיל את המצע הנכון, יכול להיות הבקיע הפלאק; שלטים כחולים מצביעים על גן שעבר מוטציה לאצי, ואילו הפלאק ברור נמל wild-type. התדירות של כחול (בין ברור) הפלאק מציינת את תדירות המוטציה באוכלוסיית התא המקורית את ה-DNA היה שחולצה מן. רצף הגן לאצי המוטציה יציג את מיקומם של המוטציות בגן והסוג של מוטציה.
מודל העכבר המהונדס האצים הוא מבוסס היטב כin vivo assay mutagenesis. יתר על כן, העכברים וריאגנטים עבור assay זמינים מסחרי. כאן אנו מתארים בפירוט כיצד מודל זה ניתן להתאים למדוד את תדירות מוטציות DNA מתרחש באופן ספונטני בלין המועשר בתאי גזע – IL7R – SCA-1 + cKit + + (LSתאי K) ואוכלוסיות אחרות של מערכת hematopoietic.
Introduction
ברוב הרקמות, תאים מובחנים תוחלת חיים מוגבלת. כדי לשמור על שלמות פונקציונלית, תאי גזע חיים ארוכים, רקמות ספציפיות ברציפות לייצר תאי אב שבתורו להצמיח תאים המובחנים באופן מלא הנדרשים לתפקוד של רקמה מסוימת. תאי גזע גם לחדש את התא שלהם באמצעות תהליך הנקרא התחדשות עצמית. לכן, תאי גזע אחראים לשמירה על השלמות הפונקציונלית של הרקמה שהם מתגוררים בי לכן, זוהי חובתו הם מצוידים במנגנונים חזקים כדי לחוש ואפשרות לתקן דנ"א פגום. אם לא, הם עשויים לרכוש הפרעות מרובות גנומית (מזיקים), אשר ניתן בירושה לצאצאיהם. הבנה כיצד תאי גזע בטוחים לשמור על הגנום שלהם במהלך תוחלת החיים של האורגניזם היא שאלה חשובה ועשויה לסייע לנו להבין מדוע חוסר יציבות גנומית מקושרת עם סרטן ומחלות אחרות הקשורות לגיל (הנסקרת ב 1,2).
<p class = "jove_content"> שליטה שלמות גנטית של רקמות ברמה של תאי גזע או אוכלוסיות תאים ובתאים מוקדם יכול להיות מושגת על ידי ביטול או גזע פגום (או אב) תאים באמצעות מוות של תאים, הזדקנות או בידול, ו / או על ידי תיקון יעיל ה-DNA של ניזוק. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ניתן למדוד סוגים מסוימים של תיקון דנ"א ישירות באוכלוסיות נדירות אלה 3-6. נמצא כי, למשל במערכת הדם, ניתן לתיקון הפסקות הדנ"א כפול גדיל ידי רקומבינציה הומולוגית (HR) או שאינו הומולוגיים סוף להצטרף (NHEJ), האחרון להיות תהליך תיקון של נאמנות נמוכה יותר ובכך הסיכון מוגבר לביצוע שגיאות. שניהם מנוצלים בתאי גזע hematopoietic (HSCs) 4,5, לעומת זאת, בעכברים שזה נראה זה בעיקר NHEJ בHSCs ואילו תאי אבות מוקדם לנצל משאבי אנוש 4. תצפית דומה נעשתה לתאי גזע בעור 6. מעניין לציין, כי בבני HSCs משאבי אנוש, לא NHEJ,נראה שמנגנון התיקון של בחירה עבור הפסקות גדיל כפולות 3. אם הבדל פונקציונלי בין שני המינים הוא אמיתי או רק מייצג את הבדל טכנולוגי או ניסיוני נותר לראות.הרפרטואר של תאי גזע כדי לתקן דנ"א פגום צפוי לכלול מנגנוני תיקון DNA אחרים, כגון תיקון כריתת בסיס (BER), תיקון כריתת נוקלאוטיד (נר) ותיקון אי התאמה (MMR). BER והנר אחראים לתיקון נגעי זוג בסיס יחיד או מרובים ב-DNA חד גדילים, ואילו חוסר התאמה תיקוני MMR בסיס בסיס ולולאות הכנסה / מחיקה, אלו סוגים של נזק לדנ"א לא ניתן לתיקון על ידי NHEJ או משאבי אנוש. תמיכה ברעיון זה כמה מחקרים ממערכת hematopoietic הוכחת קשר בין שינויים באחד מהמסלולים האלה וליקויים בתא HSC 7-9, כמו גם סיכון מוגבר לפתח תסמונת myelodysplastic 10-16, מחלה שמקורה בHSC וכי הוא קשור עם עלייה בחוסר יציבות גנומית ככל שהמחלה מתקדמת 17. כמו של עוד, מדידות של BER, נר, וMMR ישירות בHSCs לא דווחו.
בנוסף להבהרת התהליכים השונים השולטים בשלמות רקמות ברמה המכניסטית, זה הכרחי כדי שתוכל למדוד את המידה של ה-DNA שעבר מוטציה, כך שההשלכות של סטיות באחד מהתהליכים אלה ניתן לבדוק, למשל ברגילים לעומת גנטי תאי גזע מהונדסים או בישן מול צעיר. עם זאת, הפיתוח של assay רלוונטי הוא קשה בגלל המחסור בתאי גזע רקמות ספציפיות וחוסר תנאי תרבות המשמר את "stemness". יתר על כן, assay כזה צריך להיות amendable למניפולציות סביבתיות וגנטיות. פתרון אפשרי למגבלות ולדרישות הללו הוא השימוש במודלים של עכברים שהונדסו במיוחד כדי לזהות מוטציות בדנ"א.
מולמודלים עכבר מהונדסים טייפל לזיהוי מוטציה פותחו. לדוגמא, עכברים הטרנסגניים לאצי 18 לשאת וקטור הפאג λ ההשבה קידוד מערכת כתב לאצי, שבו גן מקודד לאצי מדכא של המפעיל לאק ומשמש ככתב המוטציה. עם המוטציה של הגן לאצי, מפעיל Lac מופעל וβ-galactosidase מיוצר. דבק β-galactosidase X-gal chromogenic המצע (5-bromo-4-כלורו-e-indolyl-β-D-galactopyranoside), שהופך אותו כחול. Cos אתרי איגוף וקטור האצים מאפשר התאוששות קלה על ידי חלבוני הפאג מבדה והזיהום הבא של א ' coli. לאחר דוגרים ה נגועה coli על agarose המכיל את מצע X-gal, יכול להיות הבקיע הפלאק. שלטים כחולים מכילים מוטציה המשוערת לאק, אני נושא הפאג, ואילו הפלאק ברור נמל שאינם מוטציות. התדר של שלטים כחולים (בין הדואר ברור אלה) מציין את תדירות המוטציה באוכלוסיית התא המקורית את ה-DNA שמופקת. יתר על כן, הפאג λ אירוח יעד האצים יכול להיות רצף בקלות באמצעות טכניקות PCR לניתוח תפוקה גבוהה יחסית. רצף הגנים של אצי מוטציה מרובים יחשוף מידע חשוב על ספקטרום המוטציה, אשר בתורו עשוי להצביע על ליקויים אפשריים במסלולי תיקון DNA ספציפיים או לאירועי genotoxic ספציפיים. המערכת המהונדס האצים כבר טופל בכל מעבדות מרובות 19 והחומרים הכימיים זמינים באופן מסחרי. חסרון עיקרי אחד של המערכת לאצי הוא היכולת המוגבלת לגילוי מחיקות או שחלופים גדולים, ולכן, בשיטות אחרות, כגון דגי צבע רב על מרווחי metaphase צריכים לשמש כדי להחמיא מחסור זה.
בתוך וקטור הפאג λ של מודל עכבר לאצי, יש גן קטן בהרבה, כת"ש, זמין עבור ניתוח מוטציה. הגודל שלה והעובדה שניתן לבחור מוטציות שעושים את זה assay עתיר עבודה וזולה פחות 20 מהניתוח הגנטי לאצי. עם זאת, את הגן לאצי הוא למד באופן נרחב יותר לmutagenesis 21 והרגישות של הגן למוטציות כבר מאופיין היטב, כך שיש הבנה ברורה של שאריות חומצת אמינו שיוצרות תגובת פנוטיפי על מצע chromogenic 22-25.
דגמי עכבר אחרים לזיהוי מוטציה לכלול את השימוש של ΦX174 או transgenes LacZ. מודל ΦX174 המהונדס העכבר, עם המקורי: T → G: מוטציה חזרה C assay 26 או assay המוטציה קדימה 27 המאפשר זיהוי של ספקטרום של החלפות זוג בסיס, מייצג מערכת פחות יקרה מאשר המודל לאצי. עם זאת, מסך מוטאציות בassay קדימה אינו טריוויאלי ומפרט המוטציהמוסטרום של transgene ΦX174 לא כמאופיין היטב כמו זה של לאצי. במודלים של עכברים שנשאו transgenes LacZ, כתב מוטאציות LacZ הוא התאושש ניצול E. תאי מארח coli שרגישים לגלקטוז ובינוני המכיל גלקטוז 28. חסרון של שיטה זו הוא שהתאוששות של יעד LacZ כרוך גם עיכול endonuclease הגבלה ואחרי קשירה וelectroporation של א ' coli מארח, ובכך הופך אותו קשה להתאים את המערכת למספר קטן של תאים. למרות זאת הוא לא דרישה מוחלטת לעבודה עם אוכלוסיות תאי גזע / אב (תמיד אפשר להתחיל עם יותר עכברים), אם מספר גדול של תאים נדרשים (לדוגמא במיליונים או יותר) זה יהיה לא מעשי ועלות אוסרני במהירות. כמו כן, הגודל גדול יחסית של LacZ, תוך מתן כתב מוטאציות רגיש, הוא מסורבל ויקר יותר לניתוח רצף ה-DNA וdetermination של ספקטרום מוטציה. יתרון עיקרי של מודל זה לעומת זאת, הוא יכולתה לזהות מחיקות והוספות גדולות, כמו גם שחלופים בכרומוזומים.
מכיוון שכל התאים במודלי העכבר מהונדסים לאצי, ΦX174 וLacZ לשאת את המערכת העיתונאית, כל אחד ממודלים של עכברים אלה יכול לשמש למדידת mutagenesis בכל סוג תא של עניין, כולל בתאי גזע ואב, כל עוד הם יכולים להיות שנקטפו באופן מהימן ובכמות מספקת. כי היו לנו ניסיון רב עם מודל עכבר לאצי וassay המוטציה לאצי, החלטנו להמשיך את המערכת הזו עוד יותר לניתוח mutagenesis בגזע hematopoietic ואוכלוסיות אב.
רקמות hematopoietic היא מאופיינות היטב במונחים של הפנוטיפ של הרכיבים הבודדים שלה, כוללים בתאי גזע repopulating לטווח ארוך, אשר ניתנים לזיהוי כאוכלוסייה נדירה ביותר של לין פני תא – IL7R <sup> – SCA-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 – CD150 + CD48 – תאי 29. . Mohrin אח' 4 הראו כי האוכלוסייה הגדולה במעט של LSK/Flk2 – תאים הם עדיין נציגים טובים לHSCs ושונה באופן משמעותי מהאב מיאלואידית מחויב הפרימיטיבי ביותר אוכלוסייה (CMP) כשזה מגיע ללימוד תיקון DNA. יתר על כן, כאשר LSK המועשר-HSC (flk-2 + וflk-2 -) תאים הושוו ללין – IL7R – SCA-1-cKit + + (תאי אב LS-K), יש עדיין היה הבדל משמעותי ב יכולת NHEJ 5 בין פחות טהור, גזע אוכלוסיית LSK המועשר בתאים ותאי האב. במחקר שלנו אנו משתמשים HSC מועשר LSK (flk-2 + וflk-2 -) תאים כי מצאנו כי לפחות 2 x 10 5 תאים נדרשים לתוצאות עקביות, אמינות בassay mutagenesis זה; מספר תא זה קשה מאודלהשיג כאשר אחד ממיין את LSK/Flk2 – אוכלוסיית CD150 + CD48 או אפילו LSK/Flk2 – האוכלוסייה (במונחים של עכברים, עלויות ומעשיות). פרוטוקול זה, המבוסס על אחד שפותח במקור על ידי קולר et al. 18 מתאר בפירוט כיצד תדירות המוטציה הספונטנית DNA ניתן לקבוע בתאי LSK והוגדרה אוכלוסיות של תאי מיאלואידית מובחנים, כמו גם תאי מח עצם unseparated וטחול.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo assay mutagenesis המתואר כאן מבוסס על המודל של עכברים הטרנסגניים לאצי שנוצר במקור על ידי קולר et al. 18 מודל זה מנצל וקטור הפאג λ נושא גן כתב לאצי. שני אתרי cos איגוף הווקטור לאפשר התאוששות פשוטה יחסית ואריזה שלאחר מכן לחלקיקי phage זיהומיות, נהגו ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לר 'דוד רודריגז, MA לעיצוב הגרפי וצילום בכתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון מGCCRI, NIH / NIA (5R21AG033339) וסרטן מרכז התמיכה גרנט (P30CA054174) למתקן UTHSCSA cytometry זרימת הליבה ומתקן UTHSCSA מתקדם חומצות גרעין הליבה.
Materials
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | |
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 |
| 0.025 mM pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 |
| 245 mm2 bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 |
| Agar | Fisher | BP1423-500 |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 |
| N, N-dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/coulter | A63880 |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
- Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
- Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).
- Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).
- Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
- Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).
- Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).
- Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).
- Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).
- Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).
- Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).
- Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).
- Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).
- Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).
- Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).
- Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).
- Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).
- Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327 (1-2), 57-66 (1995).
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).
- Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).
- Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).
- Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).
- Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).
- Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).
- Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. , (2001).
- Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. , (2009).
- Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. , (1992).
- Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).
- Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
- Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).
- Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).
- de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).
- Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).
- Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).
- Hilbe, J. M. . Negative Binomial Regression. second edn. , (2011).
- de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).
- Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).
