A identificação de DNA Mutações em Purificada-Tronco Hematopoéticas / células progenitoras

Summary

Descrevemos aqui um ensaio in vivo de mutagénese para pequenos números de células hematopoiéticas purificados utilizando o modelo de ratinho transgénico Lacl. O gene LacI pode ser isolado para determinar a frequência, a localização eo tipo de mutantes de DNA espontaneamente surgido ou após a exposição ao genotoxinas.

Abstract

Nos últimos anos, tornou-se evidente que a instabilidade genômica é estreitamente relacionada com muitos transtornos do desenvolvimento, câncer e envelhecimento. Tendo em conta que as células-tronco são responsáveis ​​por garantir a homeostase e reparação tecidual ao longo da vida, é razoável supor que a população de células-tronco é fundamental para a preservação da integridade genômica dos tecidos. Portanto, o interesse significativo surgiu na avaliação do impacto de fatores endógenos e ambientais sobre a integridade genômica em células-tronco e seus descendentes, com o objetivo de compreender a etiologia das doenças com base em células-tronco.

Ratinhos transgénicos LacI transportar um vector de fago λ recuperável que codifica o sistema LacI repórter, em que o gene LacI serve como o repórter mutação. O resultado de um gene mutante LacI é a produção de β-galactosidase que cliva um substrato cromogénico, transformando-azul. O sistema repórter LacI é i realizadon todas as células, incluindo as células tronco / progenitoras e podem ser facilmente recuperados e usados ​​para infectar posteriormente E. coli. Após incubação de E. infectado coli em agarose que contém o substrato correcta, as placas podem ser marcados; placas azuis indicam um gene mutante LacI, enquanto placas claras porto de tipo selvagem. A freqüência de azul (entre limpar) placas indica a frequência de mutantes na população célula original do DNA foi extraído. Sequenciação do gene mutante LacI vai mostrar a localização das mutações no gene e o tipo de mutação.

O modelo de ratinho transgénico LacI está bem estabelecido como um ensaio de mutagénese in vivo. Além disso, os ratos e os reagentes para o ensaio estão disponíveis comercialmente. Aqui nós descrevemos em detalhes como este modelo pode ser adaptado para medir a freqüência de ocorrência espontânea mutantes de DNA em células-tronco enriquecido Lin ^– IL7R ^– Sca-1 ⁺ c-kit ^{+ +} (LSCélulas K) e outras subpopulações de o sistema hematopoiético.

Introduction

Na maioria dos tecidos, células diferenciadas têm uma duração de vida limitada. Para manter a integridade funcional, células estaminais de tecidos específicos de longa duração produzir continuamente células progenitoras que, por sua vez dão origem às células totalmente diferenciadas requeridas para a função daquele tecido particular. As células-tronco também reabastecer seu próprio compartimento através de um processo chamado de auto-renovação. Assim, as células-tronco são responsáveis ​​por manter a integridade funcional do tecido eles residem dentro, portanto, é imperativo que eles são equipados com mecanismos robustos para detectar e potencialmente reparar o DNA danificado. Se não, eles podem adquirir múltiplas perturbações genômicos (potencialmente perigosos), que podem ser herdadas por seus descendentes. A compreensão de como as células-tronco salvaguardar seu genoma durante o tempo de vida de um organismo é uma questão importante e pode nos ajudar a entender por que a instabilidade genômica está relacionada com o câncer e outras doenças relacionadas com a idade (revisada em ^1,2).

<p class = "jove_content"> Controlando integridade genómica de um tecido ao nível das células estaminais ou de populações de células progenitoras no início pode ser conseguida quer eliminando haste com defeito (ou progenitora) por meio de células de morte celular, senescência ou diferenciação e / ou por reparação eficiente ADN de danificado. Estudos recentes demonstraram que é possível medir a certos tipos de reparação do ADN directamente nestas populações raras ^3-6. Verificou-se que, por exemplo, no sistema hematopoiético, quebras duplas ADN cadeia pode ser reparada por recombinação homóloga (HR) ou a extremidade não-homóloga de união (NHEJ), sendo este último um processo de reparação de baixa fidelidade e, portanto, o aumento do risco de fazer erros. Ambos estão sendo utilizados em células estaminais hematopoiéticas (HSCs) ^{de 4,5,} no entanto, em murganhos, parece que é predominantemente NHEJ no HSCs enquanto que as células progenitoras iniciais utilizam RH ^4. Uma observação semelhante foi feita por células-tronco na pele ^6. Curiosamente, em humano HSCs HR, não NHEJ,parece ser o mecanismo de reparo de escolha para a vertente breaks duplos ^3. Se essa diferença funcional entre as duas espécies é real ou apenas representa uma diferença tecnológica ou experimental continua a ser visto.

Um repertório de células-tronco para reparar o DNA danificado é susceptível de incluir outros mecanismos de reparo do DNA, como a reparação por excisão de bases (BER), reparo por excisão de nucleotídeos (NER) e reparação incompatibilidade (MMR). BER e NER são responsáveis ​​pela reparação de lesões únicas ou múltiplas pares de bases no DNA fita simples, enquanto descasamentos correções MMR base-base e alças de inserção / exclusão; estes tipos de danos no DNA não pode ser reparado por NHEJ ou RH. Apoiando esta noção de diversos estudos do sistema hematopoiético que indicam uma ligação entre as alterações em uma destas vias e anormalidades no compartimento HSC ^7-9, bem como um risco aumentado de desenvolvimento de síndrome mielodisplásica ^10-16, uma doença que se origina naHSC e que está associada com o aumento da instabilidade genómica como a doença progride ^17. Até o momento, não foram relatados medidas de BER, NER e MMR diretamente em HSCs.

Além de elucidar os vários processos que controlam a integridade do tecido a um nível mecanístico, é imperativo para ser capaz de medir a extensão de ADN mutado, de modo que as consequências das aberrações em que um destes processos pode ser testada, por exemplo, normal versus geneticamente células-tronco modificadas ou no velho contra jovens. No entanto, o desenvolvimento de um ensaio relevante é difícil devido à escassez de células estaminais de tecidos específicos e a falta de condições de cultura que preserva "stemness". Além disso, um tal ensaio deve ser modificável para manipulações genéticas e ambientais. Uma possível solução para estas limitações e exigências é a utilização de modelos de rato, que são especificamente projectados para detectar mutações no DNA.

Mulmodelos de ratinhos transgénicos tiple para a detecção de mutações têm sido desenvolvidos. Por exemplo, o LACI ratinhos transgénicos ¹⁸ transportar um vector de fago λ recuperável que codifica o sistema LacI repórter, em que o gene codifica um supressor de LacI do operador Lac e serve como o repórter mutação. Após a mutação do gene LacI, o operador Lac é activado e β-galactosidase produzida. cliva β-galactosidase do substrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-e-indolil-β-D-galactopiranósido), o que a torna azul. Os cos locais de acompanhamento do vetor LacI permite a recuperação fácil por proteínas do fago lambda e posterior infecção de E. coli. Após incubação de E. infectado coli em agarose que contém o substrato X-gal, as placas podem ser marcados. As placas azuis conter um mutante putativo Lac-I transportando fago, enquanto placas claras porto não mutantes. A freqüência de placas azuis (entre ªe as claras) indica que a frequência de mutação na população de células original é o DNA foi extraído a partir de. Além disso, o fago λ hospeda o alvo LacI pode ser facilmente sequenciada utilizando técnicas de PCR para análise relativamente alto rendimento. Seqüenciamento múltiplos genes mutantes LacI irá revelar informações importantes sobre o espectro de mutação, o que pode apontar para possíveis deficiências nas vias de reparo de DNA específicas ou eventos genotóxicos específicos. O sistema transgênico LacI foi padronizado em vários laboratórios ¹⁹ e os reagentes estão disponíveis comercialmente. Uma grande desvantagem do sistema LacI é a capacidade limitada para detectar grandes deleções ou rearranjos e, portanto, outros métodos, por exemplo, FISH multi-color em metáfase precisam ser usados ​​para complementar essa deficiência.

Dentro do vector de fago λ do modelo do rato LacI, existe um gene muito menor, CII, Disponível para análise de mutação. O seu tamanho e ao facto de que os mutantes podem ser seleccionados torna este um ensaio de trabalho intensivo e mais barato menos ²⁰ do que a análise do gene LacI. No entanto, o gene LacI está mais extensivamente estudado para a mutagénese ²¹ e a sensibilidade do gene de mutações foi bem caracterizada de modo a que existe um claro entendimento dos resíduos de aminoácidos que produzem uma resposta fenotípica sobre um substrato cromogênico ^22-25.

Outros modelos de ratinho para a detecção de mutações incluem a utilização do ΦX174 ou os transgenes LacZ. O modelo de camundongo transgênico ΦX174, com o Um original de: T → G: mutação reversão C ensaio ²⁶ ou no ensaio de mutação para a frente ^27, que permite a detecção de um espectro de substituição de pares de base, representa um sistema menos oneroso do que o modelo LacI. No entanto, a tela mutacional no ensaio para a frente não é trivial e a especificação mutaçãotro do transgene ΦX174 não é tão bem caracterizados como a do LACI. Em modelos de ratos portadores transgenes LacZ, o repórter mutacional LacZ é recuperado utilizando E. células hospedeiras de E. coli que são sensíveis à galactose e meio contendo galactose ^28. Uma desvantagem deste sistema é que a recuperação do alvo LacZ também envolve a digestão com endonuclease de restrição seguida por ligação e a electroporação de E. coli hospeda, tornando assim difícil para adaptar o sistema para um pequeno número de células. Embora não seja uma exigência absoluta para o trabalho com populações de células tronco / progenitoras (sempre se pode começar com mais ratos), se um grande número de células são necessárias (por exemplo, milhões ou mais) ele vai rapidamente tornar-se impraticável e de custo proibitivo. Além disso, o tamanho relativamente grande de LacZ, enquanto proporciona um repórter sensível mutacional, é pesado e mais dispendioso para a análise de sequência de ADN e determminação de espectros de mutações. Uma grande vantagem deste modelo no entanto, é a sua capacidade de detectar grandes deleções e inserções, bem como os rearranjos cromossómicos.

Uma vez que todas as células nos modelos de ratinho transgénicos LacI, LacZ ΦX174 e transportar o sistema repórter, qualquer destes modelos de rato pode ser utilizado para medir a mutagénese em qualquer tipo de células de interesse, incluindo as células estaminais e progenitoras, contanto que eles possam ser colhidos de forma fiável e em número suficiente. Porque nós tivemos uma vasta experiência com o modelo do rato LacI eo ensaio de mutação LacI, decidimos prosseguir este sistema ainda mais para a análise de mutagênese em tronco hematopoiéticas e populações progenitoras.

O tecido hematopoiético é bem caracterizada em termos de fenótipo da superfície celular de seus componentes individuais, incluindo repovoamento de células-tronco de longo prazo, que são identificáveis ​​como a população extremamente rara de Lin ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ c-kit ^{+ +} (LSK) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– células ^29. . Mohrin et al ⁴ demonstraram que o ligeiramente maior população de LSK/Flk2 ^– células ainda são bons representantes para HSCs e significativamente diferente do mais primitivo progenitor mielóide comprometido população (CMP), quando se trata de estudar o reparo do DNA. Além disso, quando o LSK HSC enriquecido (Flk-2 ⁺ e Flk-2 ^-), as células foram comparados com o Lin ^– IL7R ^– Sca-1-c-kit ^{+ +} (células progenitoras LS-K), há ainda uma diferença significativa nas NHEJ capacidade ⁵ entre o menos puro, caule enriquecida com células população LSK e as células progenitoras. Em nosso estudo utilizamos HSC-enriquecido LSK (Flk-2 ⁺ e Flk-2 ^-) células porque descobrimos que pelo menos 2 x 10 ⁵ células são necessários para resultados consistentes e confiáveis ​​neste ensaio mutagênese, o número de células é extremamente difícilobter quando se classifica a LSK/Flk2 ^– população CD150 ⁺ CD48 ou mesmo o LSK/Flk2 ^– população (em termos de ratos, custos e praticidade). Este protocolo, com base no originalmente desenvolvida por Kohler et al. ¹⁸ descreve em pormenor a forma como a frequência de mutação espontânea de ADN pode ser determinada em células LSK e populações de células mielóides diferenciados, bem como células de medula óssea e do baço não separada definida.

Protocol

Leucócitos de ratinhos transgénicos LacI num fundo de C57BL / 6 não expressam a Sca-1 (Figura 1). Portanto, se Sca-1 é um marcador utilizado para a purificação de células, estes ratos necessitam de ser cruzadas com uma estirpe apropriada para ganhar Sca-1 expressão; neste protocolo a F1 de um cruzamento entre ratinhos C57BL / 6 (B6) e ratinhos LacI regulares (C57BL / 6) ratinhos transgénicos (LacI), foi utilizado (Figura 1). Das populações de célul…

Representative Results

O ensaio de mutagênese vivo mede um evento raro (PFUs mutante), entre muitos eventos (todos PFUs). Ao realizar o ensaio com pequeno número de células, é possível que o resultado é consideravelmente influenciado por resultados falsos positivos e falsos negativos. Para abordar esta questão foi realizado um experimento de diluição em série com células da medula óssea não fraccionada, colhidas a partir de três animais diferentes. Medimos a frequência de mutantes na medula óssea destes…

Discussion

O ensaio de mutagénese in vivo aqui descrita baseia-se no modelo de ratinho transgénico LacI originalmente gerado por ¹⁸ Kohler et al. Este modelo utiliza um vector de fago λ portador de um gene repórter de lacl. Os dois sítios cos do vector que flanqueiam permitir uma recuperação relativamente simples e subsequente empacotamento em partículas de fago infecciosas, utilizados para infectar E. coli. Uma placa azul será gerado por infectadas com fago…

Materials

LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880