शुद्ध hematopoietic स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं में डीएनए म्यूटेशन की पहचान
Summary
यहाँ हम Laci ट्रांसजेनिक माउस मॉडल का उपयोग कर शुद्ध रक्त कोशिकाओं की कम संख्या के लिए एक Vivo में mutagenesis परख का वर्णन. Laci जीन डीएनए म्यूटेंट की आवृत्ति, स्थान, और प्रकार अनायास पैदा हुई या genotoxins से संपर्क के बाद निर्धारित करने के लिए अलग किया जा सकता है.
Abstract
हाल के वर्षों में, यह जीनोमिक अस्थिरता कसकर कई विकासात्मक विकारों, कैंसर, और उम्र बढ़ने से संबंधित है कि स्पष्ट हो गया है. स्टेम कोशिकाओं को जीवन भर ऊतक homeostasis और मरम्मत सुनिश्चित करने के लिए जिम्मेदार हैं कि यह देखते हुए, यह स्टेम सेल की आबादी के ऊतकों के जीनोमिक अखंडता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है कि परिकल्पना को उचित है. इसलिए, महत्वपूर्ण ब्याज स्टेम सेल आधारित रोगों के एटियलजि समझने के लिए लक्ष्य, जीनोमिक स्टेम कोशिकाओं में अखंडता और उनकी संतान पर अंतर्जात और पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव का आकलन करने में उत्पन्न हो गई है.
Laci ट्रांसजेनिक चूहों Laci जीन उत्परिवर्तन पत्रकार के रूप में कार्य करता है जिसमें Laci संवाददाता प्रणाली, एन्कोडिंग एक वसूली λ फेज वेक्टर ले. एक उत्परिवर्तित Laci जीन का परिणाम है कि cleaves नीले यह अब एक वर्णजनीय सब्सट्रेट, β-galactosidase का उत्पादन होता है. Laci संवाददाता प्रणाली किए मैं हैस्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं सहित और आसानी से बरामद किया और बाद में ई. को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है n सभी कक्षों, कोलाई. संक्रमित ई. incubating के बाद सही सब्सट्रेट होता है कि agarose पर कोलाई, सजीले टुकड़े रन बनाए जा सकते हैं, स्पष्ट सजीले टुकड़े जंगली प्रकार बंदरगाह जबकि ब्लू प्लैक्स, एक उत्परिवर्ती Laci जीन का संकेत मिलता है. सजीले टुकड़े (स्पष्ट) के बीच में नीले रंग की आवृत्ति डीएनए से निकाला गया था मूल सेल की आबादी में उत्परिवर्ती आवृत्ति इंगित करता है. उत्परिवर्ती Laci जीन अनुक्रमण जीन में उत्परिवर्तन के स्थान और उत्परिवर्तन के प्रकार दिखाएगा.
Laci ट्रांसजेनिक माउस मॉडल एक Vivo में mutagenesis परख के रूप में अच्छी तरह से स्थापित है. इसके अलावा, परख के लिए चूहों और अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. यहाँ हम इस मॉडल को अनायास स्टेम सेल समृद्ध लिन में डीएनए म्यूटेंट होने वाली की आवृत्ति को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि कैसे विस्तार से वर्णन – IL7R – SCA-1 + cKit + + (रासकश्मीर) कोशिकाओं और hematopoietic प्रणाली के अन्य subpopulations.
Introduction
सबसे ऊतकों में, विभेदित कोशिकाओं को एक सीमित जीवन काल है. कार्यात्मक अखंडता बनाए रखने के लिए, लंबे समय रहते, ऊतक विशेष स्टेम सेल लगातार बारी में है कि विशेष रूप से ऊतक के समारोह के लिए आवश्यक पूरी तरह से विभेदित कोशिकाओं को जन्म दे कि पूर्वज कोशिकाओं का उत्पादन. स्टेम कोशिकाओं को भी आत्म नवीकरण नामक एक प्रक्रिया के माध्यम से अपने स्वयं के डिब्बे की भरपाई होगी. इस प्रकार, स्टेम सेल वे इसलिए अंदर निवास ऊतक के कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखने के लिए जिम्मेदार हैं, यह वे क्षतिग्रस्त डीएनए भावना और संभावित सुधार के लिए मजबूत तंत्र से लैस हैं कि जरूरी है. यदि नहीं, तो वे अपनी संतान से विरासत में मिला जा सकता है जो कई जीनोमिक (संभवत: हानिकारक) perturbations, प्राप्त कर सकते हैं. स्टेम कोशिकाओं को एक जीव के जीवन काल के दौरान उनके जीनोम सुरक्षित गार्ड समझ कैसे एक महत्वपूर्ण सवाल है और जीनोमिक अस्थिरता कैंसर और (1,2 में समीक्षा) कुछ अन्य उम्र से संबंधित बीमारियों के साथ जुड़ा हुआ है यही कारण है हमें यह समझने में मदद कर सकते हैं.
<p clगधा = "jove_content"> स्टेम सेल या जल्दी पूर्वज सेल आबादी के स्तर पर एक ऊतक के जीनोमिक अखंडता को नियंत्रित / कोशिका मृत्यु, बुढ़ापा या भेदभाव के माध्यम से कोशिकाओं दोषपूर्ण स्टेम (या पूर्वज) को नष्ट करने और किसी के द्वारा या कुशल मरम्मत के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है के क्षतिग्रस्त डीएनए. हाल के अध्ययनों से यह इन दुर्लभ आबादी 3-6 में सीधे डीएनए की मरम्मत के कुछ प्रकार के उपाय संभव है कि प्रदर्शन किया है. यह उदाहरण के लिए hematopoietic प्रणाली में, डबल कतरा डीएनए को तोड़ता (NHEJ), बाद कम निष्ठा की मरम्मत की प्रक्रिया की जा रही है और बनाने के इस प्रकार खतरा बढ़ शामिल होने के मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) या गैर मुताबिक़ अंत तक ठीक हो सकता है, पाया गया कि त्रुटियों. दोनों hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) 4,5 में उपयोग किया जा रहा है, हालांकि, चूहों में यह जल्दी progenitors कोशिकाओं ऑफिस 4 का उपयोग जबकि यह HSCs में मुख्य रूप से NHEJ है लगता है. इसी प्रकार का एक अवलोकन त्वचा 6 में स्टेम कोशिकाओं के लिए बनाया गया था. दिलचस्प है, मानव HSCs ऑफिस में, नहीं NHEJ,डबल भूग्रस्त टूटता 3 के लिए पसंद की मरम्मत तंत्र हो रहा है. दो प्रजातियों के बीच इस कार्यात्मक अंतर वास्तविक है या महज एक तकनीकी या प्रयोगात्मक अंतर का प्रतिनिधित्व करता है चाहे देखने की बात है.क्षतिग्रस्त डीएनए की मरम्मत के लिए एक स्टेम सेल के प्रदर्शनों की सूची इस तरह के आधार छांटना मरम्मत (हिट), न्यूक्लियोटाइड छांटना मरम्मत (एनईआर) और बेमेल मरम्मत (एमएमआर) जैसे अन्य डीएनए की मरम्मत तंत्र, शामिल होने की संभावना है. डीएनए की क्षति के इन प्रकार NHEJ या मानव संसाधन द्वारा मरम्मत नहीं की जा सकती, एमएमआर को हल करता आधार आधार बेमेल और सम्मिलन / विलोपन छोरों जबकि प्रासंगिकता और एनईआर, एकल असहाय डीएनए में एक या कई आधार जोड़ी घावों की मरम्मत के लिए जिम्मेदार हैं. इस समर्थन धारणा HSC डिब्बे 7-9 में इन रास्ते और असामान्यताएं में से एक में परिवर्तन के बीच एक कड़ी का प्रदर्शन hematopoietic प्रणाली है, साथ ही myelodysplastic सिंड्रोम 10-16, में निकलती है कि एक बीमारी के विकसित होने का एक बढ़ा जोखिम से कई अध्ययन कर रहे हैंHSC और उस बीमारी 17 प्रगति के रूप में जीनोमिक अस्थिरता में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है. अभी तक के रूप में, सीधे HSCs में हिट, एनईआर, और एमएमआर की माप की सूचना नहीं किया गया है.
एक यंत्रवत स्तर पर ऊतक अखंडता को नियंत्रित करने वाली विभिन्न प्रक्रियाओं elucidating के अलावा, यह इन प्रक्रियाओं में से एक में aberrations के परिणामों को आनुवंशिक रूप से बनाम सामान्य में जैसे, परीक्षण किया जा सकता है, ताकि उत्परिवर्तित डीएनए की सीमा को मापने के लिए सक्षम होने के लिए आवश्यक है इंजीनियर स्टेम सेल या युवा बनाम पुराने में. हालांकि, एक प्रासंगिक परख के विकास की वजह से ऊतक विशेष स्टेम कोशिकाओं की कमी और "stemness" को बरकरार रखता है कि संस्कृति की स्थिति की कमी की वजह से मुश्किल है. इसके अलावा, इस तरह के एक परख पर्यावरण और आनुवंशिक जोड़तोड़ को सुधारने योग्य होना चाहिए. इन सीमाओं और आवश्यकताओं के लिए एक संभव समाधान विशेष रूप से डीएनए उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए इंजीनियर हैं कि माउस मॉडल का इस्तेमाल होता है.
एमयूएलउत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए टिपल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल विकसित किया गया है. उदाहरण के लिए, Laci ट्रांसजेनिक चूहों 18 Laci जीन लाख ऑपरेटर के एक शमन encodes और उत्परिवर्तन पत्रकार के रूप में कार्य करता है जिसमें Laci संवाददाता प्रणाली, एन्कोडिंग एक वसूली λ फेज वेक्टर ले. Laci जीन के उत्परिवर्तन होने पर, लाख ऑपरेटर सक्रिय है और β-galactosidase उत्पादन किया जाता है. β-galactosidase cleaves यह नीला पड़ जाता है जो वर्णजनीय सब्सट्रेट एक्स लड़की (5 ब्रोमो-4-क्लोरो ए indolyl-β-D-galactopyranoside),. Laci वेक्टर flanking क्योंकि साइटों लैम्ब्डा फेज प्रोटीन और ई. के बाद के संक्रमण से आसान वसूली की अनुमति देता है कोलाई. संक्रमित ई. incubating के बाद कोली एक्स लड़की सब्सट्रेट होता है कि agarose पर, सजीले टुकड़े रन बनाए जा सकते हैं. स्पष्ट सजीले टुकड़े गैर म्यूटेंट बंदरगाह जबकि ब्लू प्लैक्स, लाख, मैं फेज ले जाने के एक ख्यात उत्परिवर्ती होते हैं. वें के बीच ब्लू प्लैक्स की आवृत्ति (ई स्पष्ट वाले) डीएनए से निकाला गया था मूल सेल की आबादी में उत्परिवर्ती आवृत्ति इंगित करता है. इसके अलावा, Laci लक्ष्य की मेजबानी λ फेज आसानी से अपेक्षाकृत उच्च throughput विश्लेषण के लिए पीसीआर तकनीक का उपयोग कर अनुक्रम किया जा सकता. कई उत्परिवर्ती Laci जीन अनुक्रमण बारी में विशिष्ट डीएनए की मरम्मत रास्ते में संभव कमियों को या विशिष्ट genotoxic घटनाओं के लिए बात कर सकते हैं, जो उत्परिवर्तन स्पेक्ट्रम, के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी का खुलासा करेंगे. Laci ट्रांसजेनिक प्रणाली कई प्रयोगशालाओं 19 के पार मानकीकृत किया गया है और अभिकर्मकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. Laci प्रणाली का एक बड़ा नुकसान बड़े विलोपन या rearrangements पता लगाने के लिए सीमित क्षमता है, इसलिए मेटाफ़ेज़ फैलता है पर अन्य विधियों, जैसे बहु रंग मछली इस कमी तारीफ करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
Laci माउस मॉडल की λ फेज वेक्टर के भीतर, एक बहुत छोटे जीन, सीआईआई है, उत्परिवर्तन विश्लेषण के लिए उपलब्ध. इसका आकार और म्यूटेंट चुना जा सकता है कि तथ्य यह Laci जीन विश्लेषण से एक कम श्रम प्रधान और सस्ता परख 20 में आता है. एक वर्णजनीय सब्सट्रेट 22-25 पर एक प्ररूपी प्रतिक्रिया उत्पन्न कि अमीनो एसिड के अवशेष का एक स्पष्ट समझ है कि वहाँ इतना हालांकि, Laci जीन अधिक बड़े पैमाने पर mutagenesis के 21 और परिवर्तन करने के लिए जीन की संवेदनशीलता के लिए अध्ययन किया है अच्छी तरह से बताया गया है.
उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए अन्य माउस मॉडल ΦX174 या lacZ transgenes का उपयोग शामिल है. टी → जी: मूल एक साथ ΦX174 ट्रांसजेनिक माउस मॉडल, सी प्रत्यावर्तन उत्परिवर्तन परख 26 या आधार जोड़ी प्रतिस्थापन की एक स्पेक्ट्रम का पता लगाने, Laci मॉडल की तुलना में एक कम महंगा प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है की अनुमति देता है कि आगे उत्परिवर्तन परख 27. हालांकि, आगे परख में उत्परिवर्तनीय स्क्रीन तुच्छ और उत्परिवर्तन कल्पना नहीं हैΦX174 transgene की Trum रूप Laci के रूप में अच्छी तरह से विशेषता नहीं है. LacZ transgenes ले जाने के माउस मॉडल में, lacZ उत्परिवर्तनीय संवाददाता ई. उपयोग बरामद galactose और galactose 28 युक्त मध्यम के प्रति संवेदनशील हैं कि कोलाई मेजबान कोशिकाओं. इस प्रणाली का एक दोष lacZ लक्ष्य की वसूली भी ई. के बंधाव और electroporation द्वारा पीछा प्रतिबंध endonuclease पाचन शामिल है कोली जिससे यह मुश्किल कोशिकाओं की कम संख्या के लिए प्रणाली अनुकूलन, जिससे मेजबान. यह स्टेम / पूर्वपुस्र्ष सेल आबादी के साथ काम करने के लिए एक परम आवश्यकता (एक हमेशा अधिक चूहों के साथ शुरू कर सकते हैं) नहीं है हालांकि कोशिकाओं की संख्या में (जैसे लाखों या अधिक) के लिए आवश्यक हैं, तो यह जल्दी से अव्यावहारिक और लागत निषेधात्मक बन जाएगा. एक संवेदनशील उत्परिवर्तनीय संवाददाता प्रदान करते हुए इसके अलावा, lacZ के अपेक्षाकृत बड़े आकार, बोझिल और डीएनए अनुक्रम विश्लेषण और determ के लिए और अधिक महंगा हैउत्परिवर्तन स्पेक्ट्रा की ination. इस मॉडल का एक बड़ा फायदा हालांकि, इसकी बड़ी विलोपन और सम्मिलन पता लगाने की क्षमता है, साथ ही गुणसूत्र rearrangements है.
Laci, ΦX174 और lacZ ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में सभी कक्षों संवाददाता प्रणाली ले जाने के बाद, इन माउस मॉडल के किसी भी रूप में वे मज़बूती से काटा जा सकता है, के रूप में स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं सहित, ब्याज की किसी भी कोशिका प्रकार में mutagenesis मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पर्याप्त संख्या में. हम Laci माउस मॉडल और Laci उत्परिवर्तन परख के साथ व्यापक अनुभव था, इसलिए हम hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष आबादी में mutagenesis के विश्लेषण के लिए आगे इस प्रणाली को आगे बढ़ाने का फैसला किया.
hematopoietic ऊतक लिन की अत्यंत दुर्लभ आबादी के रूप में पहचाने जाने योग्य हैं जो लंबी अवधि के repopulating स्टेम कोशिकाओं सहित अपनी व्यक्तिगत घटकों, की कोशिका की सतह phenotype के संदर्भ में अच्छी तरह से विशेषता है – IL7R <sup> – SCA-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 – CD150 + CD48 – कोशिकाओं 29. . यह डीएनए की मरम्मत का अध्ययन करने के लिए आता है जब कोशिकाओं को अभी भी HSCs के लिए अच्छा प्रतिनिधि हैं और सबसे आदिम प्रतिबद्ध माइलॉयड पूर्वज (सीएमपी) की आबादी से काफी अलग – Mohrin एट अल 4 LSK/Flk2 के थोड़ा बड़ा जनसंख्या का प्रदर्शन किया. इसके अलावा, जब HSC समृद्ध LSK (FLK-2 + और FLK-2 -) – IL7R – कोशिकाओं लिन की तुलना में थे Sca-1-cKit + + (रास कश्मीर पूर्वज कोशिकाओं), में एक महत्वपूर्ण अंतर अभी भी वहाँ था कम शुद्ध के बीच NHEJ क्षमता 5, सेल समृद्ध LSK आबादी और पूर्वज स्टेम कोशिकाओं. इस सेल नंबर बेहद मुश्किल है, हम कम से कम 2 x 10 5 कोशिकाओं इस mutagenesis परख में संगत, विश्वसनीय परिणाम के लिए आवश्यक हैं कि पाया क्योंकि कोशिकाओं – हमारे अध्ययन में हम LSK (FLK-2 + और FLK -2) HSC समृद्ध उपयोगCD150 + CD48 आबादी या भी LSK/Flk2 – – जनसंख्या (चूहों, लागत और व्यावहारिकता के मामले में) एक LSK/Flk2 प्रकार जब प्राप्त करने के लिए. मूल रूप से Kohler एट अल. 18 द्वारा विकसित एक के आधार पर इस प्रोटोकॉल, सहज डीएनए उत्परिवर्ती आवृत्ति विभेदित माइलॉयड कोशिकाओं की आबादी के साथ ही unseparated अस्थि मज्जा और तिल्ली कोशिकाओं LSK कोशिकाओं में निर्धारित और परिभाषित किया जा सकता है कि कैसे विस्तार से वर्णन किया गया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ बताया vivo में mutagenesis परख मूल रूप से Kohler एट अल. 18 यह मॉडल एक Laci पत्रकार जीन ले एक λ फेज वेक्टर इस्तेमाल से उत्पन्न Laci ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पर आधारित है. वेक्टर संक्रामक फेज कणों में एक अपेक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि में ग्राफिक डिजाइन और फोटोग्राफी के लिए डेविड आर रोड्रिगेज, एमए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम UTHSCSA फ्लो कोर सुविधा और UTHSCSA उन्नत न्यूक्लिक एसिड कोर सुविधा के लिए GCCRI, एनआईएच / एनआईए (5R21AG033339) और कैंसर केंद्र सहायता अनुदान (P30CA054174) से धन के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | |
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 |
| 0.025 mM pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 |
| 245 mm2 bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 |
| Agar | Fisher | BP1423-500 |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 |
| N, N-dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/coulter | A63880 |
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