JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Bioengineering

Prosedyre for utvikling av Multi-dybde Circular Cross-sectional Endothelialized microchannels-on-a-chip

Published: October 21, 2013
doi:
10.3791/50771
, , ,
1Lane Department of Computer Science and Electrical Engineering,West Virginia University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,University of California at Riverside

Summary

En mikrokanaler-on-en-brikke plattformen ble utviklet ved kombinasjonen av fotolitografisk teknikk reflowable fotoresist, myk litografi, og MicroFluidics. Den endothelialized microchannels plattformen etterligner den tredimensjonale (3D) geometrien in vivo microvessels, kjører under kontrollerte kontinuerlig perfusjon flyt, gir høy kvalitet og real-time imaging og kan brukes for mikrovaskulær forskning.

Abstract

Det har blitt fokusert på å utvikle in vitro-analyser for studiet av microvessels fordi in vivo dyrestudier er mer tidkrevende, dyrt og observasjon og kvantifisering svært utfordrende. Imidlertid konvensjonelle in vitro assayer microvessel har begrensninger når den representerer in vivo mikrovaskulatur med hensyn til tre-dimensjonale (3D) og geometri som gir kontinuerlig strømning. Ved hjelp av en kombinasjon av fotolitografisk reflowable fotoresist teknikk, myk litografi, og MicroFluidics, har vi utviklet en multi-dybde sirkulære tverrsnitt endothelialized microchannels-on-a-chip, som etterligner 3D geometri av in vivo microvessels og kjører under kontrollerte kontinuerlig perfusjon strømning. En positiv reflowable fotoresist ble brukt til å fremstille en master-formen med et halvsirkelformet tverrsnitt microchannel nettverk. Ved justering og bonding av de to polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels Replicated fra master mold, ble en sylindrisk microchannel nettverk opprettet. Diameteren på microchannels kan være godt kontrollert. I tillegg viste primære humane umbilical vene endotel-celler (HUVECs) sådd på innsiden av brikken at cellene foret den indre overflaten av mikrokanaler med kontrollert perfusjon som varer i et tidsrom mellom 4 dager til 2 uker.

Introduction

Microvessels, som en del av sirkulasjonssystemet, megle samspillet mellom blod og vev, støtte metabolske aktiviteter, definere vev microenvironment, og spiller en avgjørende rolle i mange helse-og patologiske tilstander. Gjentagelse av funksjonelle microvessels in vitro kunne gi en plattform for studiet av komplekse vaskulære fenomener. Imidlertid konvensjonelle in vitro microvessel assays, for eksempel endotelcellemigrasjon assays, endotelceller rør-formasjons-tester og rotte og mus aorta-ring analyser, ikke er i stand til å gjenskape in vivo mikrovaskulatur med hensyn til tre-dimensjonale (3D) geometri og kontinuerlig flytkontroll 1-8. Studier av microvessels med dyremodeller og in vivo, for eksempel hornhinnen angiogenese analysen, chick chorioallantoic membran angiogenese analysen, og Matrigel plug-analysen, er mer tidkrevende, høyt i pris, utfordrende med hensyn til observasjon og kvantifisering, ogta opp etiske problemstillinger 1, 9-13.

Fremskritt i micromanufacturing og microfluidic chip-teknologi har muliggjort en rekke innsikt i biomedisinsk vitenskap mens begrense de høye eksperimentelle kostnadene og kompleksiteten forbundet med dyr og in vivo studier 14, som enkelt og strengt kontrollert biologiske forhold og dynamiske fluidic miljøer, som ikke ville ha vært mulig med konvensjonelle mesoklimatisk teknikker.

Her presenterer vi en tilnærming for å konstruere en endothelialized microchannels-on-a-chip som etterligner 3D geometri av in vivo microvessels og kjører under kontrollerte kontinuerlig perfusjon flyten ved å bruke en kombinasjon av fotolitografisk reflowable fotoresist teknikk, myk litografi, og MicroFluidics.

Protocol

En. Photolithography Fabrikasjon av fotoresist Master Mold Følgende protokoll viser prosedyren å fremstille de mikrokanaler med diametre mellom 30-60 mikrometer. For å få en microchannel med en mindre diameter (mindre enn 30 um), et spinn-belegg av fotoresist er nødvendig. Overfør den flyt fotoresisten fra kjøleskap ved 4 ° C til renrommet 24 timer før bruk, og tillate den å oppvarmes til romtemperatur. Rengjør en silisium wafer og bake den i en time ved 150 ?…

Representative Results

Vår tilnærming for å fabrikkere den multi-dybde microchannel nettverk etterligner komplekse 3D Geometriene til in vivo mikrovaskulatur, der mikrokanaler har avrundet tverrsnitt 15.. I tillegg viser diameter på overordnede kanaler og forgreninger datterproduktene kanaler omtrent adlyde Murray lov for å opprettholde fluidstrømmen ved et ønsket nivå, slik at den samlede motstand kanalen er lav og strømningshastigheter er mer ensartet gjennom hele nettverket 16-18. Prosesser og result…

Discussion

En. Master mold fabrikasjon

En av de designe og førende for vaskulær morfometri er kjent som Murray lov 16, som sier at fordelingen av fartøy diameter i hele nettverket er styrt av minimum energi betraktning. Det sier også at tredje potens av diameteren i et overordnet fartøy ved en todeling er lik summen av de terninger av diametrene av datteren fartøy ( <img alt="Ligning 1" fo:content-width="0.9in" fo:src="/files/ftp_upload/50771/50771eq1.jpg" src="/files/ftp_upload/507…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble delvis støttet av National Science Foundation (NSF 1.227.359), WVU EPSCoR program finansiert av National Science Foundation (EPS-1003907), WVU ADVANCE kontor sponset av National Science Foundation (1.007.978), og WVU PSCoR, henholdsvis. Den microfabrication arbeidet ble gjort i WVU Delte Forskning Fasiliteter (renrom anlegg) og Microfluidic Integrative Cellular Forskning på Chip Laboratory (Microchip Lab) ved West Virginia University. Den confocal bildebehandling ble gjort på WVU mikroskop Imaging Facility.

Materials

Reagent/Material
Reflow Photoresist AZ Electronic Materials AZP4620
Developer AZ Electronic Materials AZ 400K
PDMS Dow Corning Corporation Sylgard 184
MCDB 131 Culture Medium Invitrogen 10372-019
NacBlue Nuclei Staining Invitrogen H1399
PKH Red Stain Sigma MINI26 and PKH26GL
Fibronectin Gibco PHE0023
L-Glutamine Sigma G7513
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14040-133
HEPES Buffered Saline Solution Lonza CC-5024
Trypsin/EDTA Invitrogen 25300-062
Trypsin Neutralizing Solution Lonza CC-5002
PDMS Curing Agent Dow Corning Corporation Sylgard 184
Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells Lonza CC-2517
Fetal Bovine Serum Lonza 14-501F
Diluent C Sigma CGLDIL
Hoechst33342 Invitrogen, Molecular Probes R37605
Dextran Sigma 95771
3.5% Paraformaldehyde Electron Microscopy Science 15710-S
Equipment
Spinner Laurell Technologies Corporation WS-400BZ-6NPP/LITE
Desiccator BelArt Products 999320237
Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
Syringe Pump System Harvard Apparatus PHD Ultra
Laminar Biosafety Hood Thermo Scientific 1300 Series A2
Planetary Centrifugal Mixer Thinky ARE-310
Isotemp Oven Fisher Scientific 13-246-516GAQ
Optical Microscope Zeiss Invertoskop 40C
Plasma Cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Hotplate Barnstead/Thermolyne Cimarec SP131635
Laser Scanning Confocal Microscope Zeiss LSM 510
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Adair, T. H. . Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , (2011).
  2. Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
  3. Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , 65-87 (2006).
  4. Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
  5. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
  6. Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
  7. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
  8. Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
  9. Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , (2008).
  10. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
  11. Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
  12. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  13. Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
  14. Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  15. Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
  16. Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
  17. Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
  18. Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
  19. Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray’s law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
  20. Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
  21. LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
  22. Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray’s law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
  23. Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  24. Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
  25. Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
  26. Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
  27. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  28. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
  29. Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
  30. Young, B., Heath, J. W. . Wheater’s functional histology: A text and colour atlas. , (2000).
  31. O’Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
  32. de Gennes, P. G. Wetting: statics and dynamics. Rev. Mod. Phys. 57, 827-863 (1985).
  33. Elias, H. G. . An Introduction to Polymer Science. , (1997).
  34. Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
  35. Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
  36. Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
  37. Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
  38. Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
  39. Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
  40. Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
  41. Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
  42. Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
  43. Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
  44. Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
  45. Schaper, W. Therapeutic arteriogenesis has arrived. Circulation. 104 (17), 1994-1995 (2001).
  46. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
  47. Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
  48. Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
  49. Darland, D. C., D’Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
  50. Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
  51. Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
  52. Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
  53. Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
  54. Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human “angiogenesis” assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
  55. Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
  56. Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
  57. Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
  58. Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).

Tags

Multi-depth Circular Cross-sectional MicrochannelsEndothelialized MicrochannelsIn Vitro Microvessels3D GeometryContinuous Fluid FlowPhotolithographic ReflowSoft LithographyMicrofluidicsPDMSPrimary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)Perfusion
check_url/50771?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Li, X., Mearns, S. M., Martins-Green, M., Liu, Y. Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip. J. Vis. Exp. (80), e50771, doi:10.3791/50771 (2013).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image