Summary
마이크로 - 온 - 칩 플랫폼은 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합에 의해 개발되었다. endothelialized 마이크로 플랫폼은 생체 내 미세 혈관에서의 3 차원 (3D) 구조를 모방 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행하고, 고품질의 실시간 영상을 허용하고 미세 혈관 연구에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
생체 내 동물 연구는 더 많은 시간이 소요되는, 비싼, 그리고 관찰과 정량화가 매우 어려운됩니다 때문에 노력은 미세 혈관의 연구를위한 생체 분석의 개발에 초점을 맞추고있다. 세 가지 차원 (3D) 형상에 대해 생체 내 미세 혈관의 대표 및 지속적인 유체 흐름을 제공 할 때 그러나, 생체 미세 혈관 분석에서 기존의 제한이 있습니다. 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합을 사용하여, 우리는 멀티 깊이 원형 단면 endothelialized 개발 한 제어 연속 관류에 따라 생체 내 미세 혈관에서의 3D 형상을 모방하고 실행 마이크로 - 온 - 칩 흐름. 긍정적 인 리플 로우 레지스트는 반원형 단면 미세 네트워크와 마스터 몰드를 제조하는 데 사용되었다. REPL 개의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 마이크로의 정렬 및 본딩마스터 금형 icated, 원통형 마이크로 네트워크를 만들었습니다. 마이크로의 직경은 잘 제어 할 수 있습니다. 또한, 칩 내부에 씨앗을 품고 기본 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs)는 세포 4 일 이주 사이의 기간 동안 지속적인 제어 관류에 따라 마이크로의 내부 표면을 지어 것으로 나타났다.
Introduction
미세 혈관은 혈액 순환 시스템의 일부로서, 혈액과 조직 사이의 상호 작용을 중재 신진 대사 활동을 지원, 조직의 미세 환경을 정의하고, 많은 건강과 병적 상태에 중요한 역할을한다. 체외에서 기능 미세 혈관의 재현부는 복잡한 혈관 현상의 연구 플랫폼을 제공 할 수 있습니다. 그러나, 내피 세포 마이 그 레이션 분석, 내피 관 형성 분석과 쥐 및 쥐 대동맥 링 분석 등의 생체 미세 혈관 분석, 종래의 입체 (3D) 형상과 연속 흐름 제어에 대해 생체 내 미세 혈관의를 다시 할 수 없습니다 1-8. 동물 모델과 같은 각막 신생 혈관 분석, 병아리 융모 막 혈관 분석 및 마트 리젤 플러그 분석 등의 생체 분석,에서를 사용하여 미세 혈관의 연구는 더 많은 시간이 소요되는 비용 높은 관찰과 quantifications에 대해 도전하고 있습니다윤리적 문제 1, 9-13 올립니다.
하지 않았을 등 쉽게 엄격하게 제어 생물학적 조건과 역동적 인 유체 환경과 같은 연구 14, 동물 생체에 관련된 높은 실험 비용과 복잡성을 축소 및 단축하면서 micromanufacturing 및 미세 유체 칩 기술의 발전은 생명 과학에 대한 통찰력의 다양한 활성화 기존의 거시적 기술로 할 수 있었다.
여기, 우리는 endothelialized를 구성하는 방법을 제시 마이크로 - 온 - 칩 생체 내 미세 혈관에서의 3D 형상을 모방하고 포토 리소그래피 리플 로우 레지스트 기술, 소프트 리소그래피, 그리고 미세 유체의 조합을 사용하여 제어 지속적인 혈류의 흐름에서 실행됩니다.
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Protocol
1. 포토 레지스트 마스터 금형의 석판 제작
다음 프로토콜은 30 ~ 60 μm의 사이 직경의 미세을 제작하는 과정을 보여줍니다. 작은 직경 (이하 30 μm의), 포토 레지스트의 단일 스핀 코팅 마이크로를 얻으려면이 필요합니다.
- 사용하기 전에 클린 24 시간에 4 ° C에서 냉장고에서 리플 로우 레지스트를 전송하고 실내 온도를 따뜻하게 할 수 있습니다.
- 실리콘 웨이퍼를 청소하고 탈수 할 수 있도록 150 ° C에서 한 시간 동안 구워. 탈수는 실리콘 기판에 포토 레지스트 접착 도움을 줄 것입니다.
- 스핀 코팅 포토 레지스트의 첫 번째 레이어는 다음과 같은 조리법을 사용하여 :
| 단계 | 시간 (초) | 속도 (rpm) | 가속 |
| 1 | 2 </ TD> | 300 | 최고 |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | 최고 |
| 4 | 60 | 600 | 최고 |
| 5 | 10 | 500 | 최고 |
| 6 | 10 | 600 | 최고 |
- 그런 다음 90 초 동안 110 ° C의 온도 열판에 웨이퍼를 굽는다. 부드러운 빵을 한 후 포토 레지스트의 두께는 20 ~ 30 μm의 수 있습니다.
- 코트에게 첫 번째 레이어에 사용되는 것과 동일한 조리법에 따라 포토 레지스트의 두 번째 레이어를 회전.
- 부드러운 빵을 90 초 동안 110 ° C의 온도 열판에 배치하여 다시 웨이퍼. 이 부드러운 빵을 한 후 포토 레지스트의 두께는 40 ~ 60 μm의 수 있습니다.
- photor를 노출하여 긍정적 인 마스터 패턴을 생성영화 마스크를 통해 14,500 엠제이 / cm 2의 노광량으로 UV 빛을 ESIST.
- 탈 (DI) 물 (1시 2분 (V / V))의 개발을 희석. 패턴이 완전히 개발 될 때까지 용액에 반복적으로 웨이퍼를 씻어. 다음 DI 물과 웨이퍼를 세척하고 질소 가스를 사용하여 말립니다.
- 리플 로우 : 4 분, 용매 증발을 방지하기 위해 유리 페트리 접시 덮개를위한 120 ° C의 온도 열판에 배치 웨이퍼. 열판에서 웨이퍼를 제거하고 실온까지 냉각 할 수 있습니다. 리플 로우 후의 레지스트 두께는 50 μm의 수 있습니다.
2. PDMS 마이크로 채널 네트워크 소프트 리소그래피 제작
- 10:1 중량 비율 (기본 : 경화제)에서 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 솔루션을 준비하고 행성 원심 믹서를 사용하여 철저하게 섞는다.
- 리플 로우 포토 레지스트 마스터 금형에 PDMS 솔루션을 캐스팅합니다. 가스를 15 분 동안 데시 케이 터에서 주조 PDMS를 놓고. 필요한 경우 남아있는 거품을 제거하기 위해 질소 가스를 사용합니다.
- 그것을 치료 할 수 있도록 3 시간 동안 60 ° C의 온도에서 오븐에 PDMS를 굽는다. 그런 다음 마스터 금형 치료 PDMS 층을 제거합니다.
- 채널 네트워크에 구멍을 펀치로 유입 / 유출 구멍을 만들 날카롭게 주먹을 사용합니다. 질소 가스를 사용하여 PDMS의 표면을 청소합니다.
- 4.5 × 10 -2 Torr의 및 3.5 피트 / 분의 산소 유량의 압력에서 플라즈마 클리너 내부에 30 초 동안 산소 플라즈마 두 PDMS 레이어를 처리합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 수동으로 PDMS의 표면을 맞 춥니 다. 물 한 방울 정렬의 더 나은 제어에 필요한 경우에 사용합니다.
- 60 ° C 영구적 인 결합을 달성하기 위해 30 분 동안 오븐에서 장치를 굽는다.
3. 칩 HUVEC 문화 및 시드
- 문화는 L-글루타민과 문화 매체와 HUVECs 10 % 태아 소 혈청 (FBS)와 보충. 일에 대한2와 5 사이에 전자 실험 구절을 사용 하였다.
- HUVECs가 합류되면, 37 ℃에서 2-6 분 동안 세포를 계산하고 최초의 HEPES이 (HEPES-BSS) 생리 식염수를 버퍼로 세포를 세척하여 그들을 수확 후 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 부화와 세포 치료 트립신이 완료된 후, 트립신을 중화 솔루션과 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 중화. 원심 분리를 수집하기 위해 8 % 덱스 트란과 문화 매체에있는 세포를 일시 중지합니다. 덱스 트란은 더 나은 세포 파종 및 첨부 돕기 위해 중간 점도를 높이기 위해 사용되었다.
- 5 4.5 × 10 -2 Torr의의 작동 압력 분 및 3.5의 산소 유량 피트 3 / 분 산소 플라즈마 장치를 취급합니다. 다음 DI 워터로 장치를로드하고 멸균 층류 생물 안전 후드에서 8 시간 동안 UV 빛으로 취급합니다.
- 세포가 준비되어 하루 전에 1X 인산염 장치를 세척 피브로넥틴 (100 ㎍ / ㎖, DIL와 코트 다음 (1X PBS) 완충 식염수1X PBS로 uted), 4 ° C에서 하룻밤 냉장고에 품어.
- 피브로넥틴 코팅 후 1X PBS 다음 배지와 부하 장치를 씻는다. 15 분 37 ° C의 온도에서 장치를 품어.
- 3-4 X 10 6 세포 / ML의 세포 농도와 8 % 덱스 트란 문화 매체에 HUVEC 세포를로드합니다. 장치의 하나 입구에서 세포의 20 μL 방울을 배치하고 미세 유체 채널에 세포를 소개를 기울이십시오. 15-20 분 후 세포는 채널의 측면 벽에 부착하기 시작합니다. 장치에게 전지보다 균일 한 분포를 생성 할 때마다 15 분을 돌립니다. 필요한 경우, 추가 하중을 수행 할 수 있습니다.
4. 장기 관류 설정
정적 문화의 5-6 시간 후, 첨부 HUVECs 완전히 확산하기 시작합니다. 10 μL / 시간의 지속적인 흐름으로 원격 제어 주사기 펌프 시스템을 사용하여 관류를 설정합니다. 관류는 F를 조정할 수 있습니다또는 더 높은 유량,는 2 주 4 일 사이 기간 동안 지속될 수있다.
5. 세포 염색 및 현미경 특성
- 세포가 장치 안에 합류에 도달하면, 첫째, 철저하게 매체를 제거 1X PBS로 장치를 세척한다. 다음 희석제 (4 μL-1 ML)로 희석 붉은 염료로 장치를로드합니다. 셀 로딩 절차와 비슷 염료를 넣습니다. 상온에서 5 분 동안 어둠 속에서 장치를 배양 한 후 염색을 중지 배지로 장치를 세척한다. 염료의 긴 배양은 세포 독성과 disadhesion가 발생할 수 있습니다.
- 1X PBS (ML 당 2 방울)에 희석 파란색 염료로 장치를로드합니다. 상온에서 5 분 동안 어둠 속에서 부화 후 철저하게 1X PBS로 장치를 세척한다.
- 거꾸로 광학 현미경으로 세포 염색을 검사합니다. 염색이 좋으면 (1X PBS로 희석 3.5 % 파라 포름 알데히드) 고정 매체로 마이크로를로드 한 후 잠수함중간과 완전히 알루미늄 호일로 커버를 고정에있는 장치. 4의 온도에 냉장고에 장치를 보관 ° C 건조하고 photobleaching에에서 장치를 방지 할 수 있습니다. 고정 장치는 이제 공 촛점 현미경 스캐닝 레이저로 할 수있는 공 촛점 이미징을위한 준비가되어 있습니다.
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Representative Results
멀티 깊이 마이크로 네트워크를 제조하는 우리의 접근 방식은 미세 크로스 섹션에게 15 반올림하는 생체 미세 혈관에서의 복잡한 3D 형상을 모방. 또한, 부모 분기 채널의 직경과 딸 채널은 대략 전체 채널 저항이 낮고 유속이 네트워크 16-18 전역에 균일 있도록 필요한 수준에서의 유체 흐름을 유지하기 위해 머레이의 법칙을 준수하십시오. 반원형 포토 레지스트 마스터 금형의 제조 및 원형 단면 PDMS 마이크로 채널 네트워크에 대한 프로세스 및 결과는 영화 1, 그림 2는 각각 영화 2에서 설명 하였다. PDMS 마이크로 채널 네트워크의 기하학적 특징은 특징과 그림 2에 나타내었다. 우리의 결과는 포토 레지스트 리플 로우 기술은 다중 깊이 분기 채널 네트워크를 만들 수 있다는 것을 보여 전NA 더 편리 포토 레지스트의 리플 로우 기술로 접근, 약 머레이의 법칙을 순종 혈관 생체 모방 시스템을 설계 할 수 있습니다.
체외 모델의 많은에서 혈관 세포는 일반적으로 평면 플레이트, 필터, 또는 하이드로 겔 코팅이 기판에서 배양된다. 이러한 조건에서 미세 혈관은 무작위로 자기 조립 세포에 의해 생성됩니다. 또한, 기존의 분석은 내피 세포에 일정한 흐름을 달성 고유의 어려움이있다. 장기 연속 미디어 흐름의 부족은 적절한 장벽 기능과 내피 세포 단일 층의 안정성을 유지하는 기능을 방지 할 수 있습니다. 우리의 모델에 적용, 미세 유체의 장점은 유체 액세스 및 제어 (유량, 기간 및 패턴 변화)뿐만 아니라 쓰레기를 치우는에 대한 편리합니다. 우리는 인간의 기본 제대 정맥 내피 세포에 대한 프로세스 (HUVECs) 마이크로에서 시드를 설명하고 설정 팅 세포 배양을위한 장기 유체 관류 시스템 (그림 3). 또한, 때문에 복잡한 형상의 생체 내 미세 혈관에, 그 작은 혈관의 실시간 모니터링이 어렵습니다. 개발 PDMS 기반의 칩은 좋은 광학 특성을 제공하며, endothelialized 마이크로 고품질의 실시간 영상을 허용합니다. (그림 4와 영화 3)
영화 1. 포토 레지스트 마스터 금형 설계도 제작 절차가. 처음, 사전 청소 실리콘 기판을 제조 하였다. 긍정적 인 리플 로우 레지스트 층은 실리콘 기판 위에 스핀 코팅 및 소성 및 건조되었다. 포토 레지스트 패턴 마스크를 통해 UV 빛에 노출시킨 후, 패턴 마이크로가 개발되었다. 반원형 단면 마이크로 네트워크는 4 분 동안 120 ° C에서 리플 로우 후에 만들어졌습니다.movie1.wmv "대상 ="_blank "> 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 1. SEM은 개발 된 포토 레지스트를 보여줍니다) 리플 로우하기 전에;. 리플 B) 한 후, C) PDMS는 리플 로우 전에 저항의 단면을 보여 성형, 그림은 직사각형 단면을 보여줍니다 D) PDMS가의 반원형 단면을 보여주는 성형 리플 로우 후 저항, 리플 로우 후 횡단면 패턴 리플 로우 온도의 초기 차원 설계에 의해 통제되었다. (참고 15에서 허가 재판). 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
영화 2. PDM의 원통형 마이크로 네트워크에 대한 개략적 인 제조 과정S. PDMS 솔루션은 포토 레지스트 곰팡이에 캐스팅, 3 시간 동안 60 ° C의 온도에서 오븐에 치료되었다. 두 개의 동일한 치료 PDMS 층, 반원형 단면 미세 네트워크를 가지고 각각은, 정렬 및 원형 단면과 마이크로를 형성하기 위해 함께 결합 하였다. 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. ) PDMS. BD에서 정렬 및 보세 원통형 미세 네트워크) 원형 PDMS 금형의 단면은 각 분기 수준 (1-1 ', 2-2', 그리고 3-3 ')에서 채널 크기를 보여줍니다. 또한, 이러한 수치는 multibranching 및 multidepth 원형 단면 미세 유체 채널 네트워크의 생성을 보여줍니다.
페이지 = "항상"> 
그림 3. 회로도는 원격 제어 주사기 펌프를 사용하여 칩을 통해 장기 관류을 표시합니다.
그림 4. 형광 세포막 염색 (적색) 그 HUVECs 라인이 다른 분기 지역에서 원통형 마이크로 네트워크의 내부 표면.) 위쪽, B) 중간, 및 C) 바닥. D) 세포 핵 염색 (파란색) 표시를 사용하여 현미경 이미지 공 촛점 현미경 이미지는 채널 네트워크를 안감 HUVECs의 원형 단면을 보여줍니다. 스케일 바 : 100 μm의.
영화 3. 원형 채널 네트워크에 따라 세포의 안감을 보여 촛점 영화.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "대상 ="_blank "> 동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
1. 마스터 금형 제작
혈관의 형태 학적위한 설계 원칙 중 하나는 네트워크를 통해 혈관 직경의 분포는 최소의 에너지 고려에 의해 지배되는 진술 머레이의 법칙 16로 알려져 있습니다. 또한 분기점에서 부모 혈관의 직경 큐브 딸 혈관의 직경 큐브의 합에 해당된다는 진술 ( 
또한) 19 Poiseuille의 법칙은 다음과 같이 혈관의 대부분에서 전단 응력의 크기를 추정하는 데 사용되었습니다 
. 하는1eq3.jpg "SRC는 ="/ files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "폭 ="25px "/>, μ는 혈액의 점도 혈역학 전단 응력이다 Q는 유량, 그리고 R은의 반경 용기 20,21. 대칭 끝점과 융기, 머레이의 법률 및 Poiseuille의 법칙에 따라 중요한 결과를위한은 벽 전단 응력이 혈관 네트워크를 통해 일정하게 유지하는 것입니다. 따라서, 원형 단면을 가진 제조 대칭 미세 유체 채널 네트워크를 들어, 채널 끝점과 융기 순종 머레이의 법칙의 치수는 혈관 내피 세포에 의해 경험 전단 응력은 서로 다른 분기 채널로 일정해야한다.
많은 미세 기술과 프로세스가 혈관 세포의 22-25에 사용되는 마이크로의 제조에 적용되었습니다, 그러나, 그 결과 마이크로의 채널 직사각형, 정사각형이나 사다리꼴 단면의 결과. 채널의 직사각형 단면은 죄수따라서 세포 생리학 26,27의 변화의 결과로, 널리 다른 채널 위치에있는 세포에 유체 전단 응력과 nonphysiological 형상을 변화 부과 할 끝점과 융기,의 날카로운 모서리와 갑작스러운 전환과 구조 상.
포토 레지스트 리플 로우 공정은 둥근 채널 프로파일의 결과로, 두 절차 1) 패턴 포토 레지스트의 용융 액체 저항 표면은 시스템 28,29과 2의 에너지를 최소화하는 형태로 뽑아됩니다) 냉각을 포함 응고 단계는 녹는 과정을 따른다. 리플 로우 채널의 모양은 잘 semicylindrical 표면에 근사한다. 리플 로우 마스터 금형 제작 다음, 표준 소프트 리소그래피 방식은 단면이 원형에 PDMS 미세 유체 채널 네트워크를 조작하는 데 사용되었다. 우리의 결과는 포토 레지스트 리플 로우 기술은 더 똑 바른의 멀티 깊이 분기 마이크로 네트워크를 만들 수있는 것으로 나타났다T 전달 방식, 그리고 우리가 서로 다른 분기 수준에서 약 전체 채널 저항이 낮은, 그래서 머레이의 법칙을 순종하고 생체 내 미세 혈관에서의 형상을 모방 미세 혈관 생체 모방 시스템 및 전단 응력의 변화를 디자인 할 수는 제작에 최소화 할 수있다 미세 유체 채널 네트워크.
생리적 혈액 미세 혈관은 30-300 μm의 30 ~ 반경 대략 원형 단면을 채택한다. 본 논문에서 입증 마이크로 네트워크의 크기가 서로 다른 분기 수준에서 60 μm의 100 μm의 주위에 변화 하였다. 생체 내 미세 혈관의 모방에 대한 직경의 다양한 범위의 마이크로을 제조하기 위해, 우리는 저항 단일 회전 레이어 리플 로우를 사용하는 것이 좋습니다 (30 μm의 제한) 또는 다른 낮은 점성 저항한다. 큰 직경 (30 ~ 60 μm의)와 마이크로를 들어, 이중 코팅 절차는 두꺼운 포토 레지스트 필름을 적용 할 수 있습니다15. 스핀 코팅 두 레이어 위에 추가가 부정확 노출 선량이 발생할 수 있습니다 불균일 한 두께를 방지하기 위해 피해야한다. 60 μm의 위의 필름 두께가 다른 높은 점성 리플 포토 레지스트를 권장합니다.
이상적인 조건에서 조작하는이 반원형 단면과 곰팡이에 저항, 필름의 두께는 초기 마이크로의 필수 폭과 초점 거리로 제공하여 미리 할 수 있습니다 
여기서, H는 필요한 회전 필름 두께, R은 채널 폭의 절반이며, R은 곡률의 일정 반경, H는 곡률의 중심 높이, 그리고 E는 전후 마이크로의 볼륨을 저항의 비율이다 31 리플 로우. 마이크로의 주어진 폭의 원통형 표면, 저항의 특정 볼륨을 다시합니다quired. 그러나 여러 매개 변수가 리플 로우 된 포토 레지스트에 영향을하고 포토 레지스트와 고체 기판 리플 로우 공정을위한 리플 로우 베이킹, 온도 및 시간 동안 제품의 소재 증발 사이의 중요한 각도와 경계 운동으로, 결과 채널 프로파일을 더 복잡하게보고되고있다 , 가스 누설 기판의 균일 성 및 속성에게 32-34을 저항한다. 예를 들어, 리플 로우 온도와 시간은 경계의 움직임을 일으키는 볼륨 변경 될 수 있으며 따라서 임계각 최종 프로파일 33 저항 리플 로우 변화 할 수 있습니다. 우리의 이전 작업 (15)에 의해보고, 리플 로우 공정 때문에 포토 레지스트 볼륨 감소와 경계 이동 평균 2 %로 채널 폭 감소했다. 또한, 원통형 표면을 얻기위한 볼륨은 리플 로우 공정 35,36 동안 제품의 소재 증발의 효과에 대한 수당을해야합니다. 다른 반경 원통형 표면을 통해 필요한 경우마이크로 네트워크는 네트워크 15 다른 지역에 볼륨의 변화의 결과로, 마이크로의 폭을 변경하는 것이 필요하다. 성공적으로 다른 직경, 폭 / 볼륨 리플 로우 온도 및 시간, 중요한 각도, 경계의 움직임, 점도와 스핀 코팅 프로토콜을 저항 기판 속성 저항을 고려하고 테스트해야합니다와 원통형 채널 네트워크를 조작합니다.
2. 장기 세포 배양
흐름과 관련된 벽 전단 응력의 중요성은 잘 내피 세포 생물학을 조절에 인정되었습니다. 이 같은 세포의 형태와 방향, 분비 조직 증식과 분화의 변화, 세포 내 신호 전달, 세포 골격 단백질 생산 유전자 발현, 혈관의 성숙과 구조 및 장벽 기능 37-47를 유도 등의 분야에서 볼 수있다. 끝을 형성 체외 방법에서 현재othelial 튜브는 일반적으로 '내피 세포에 의존 ECS () 또는 세포 외 기질 (ECM) (유형 I 콜라겐, 섬유소, 또는 마트 리젤) 48-54의 중간 엽 세포없이자가 조직입니다. 이러한 문화가 성공적으로 여러 혈관 행동, 원하는 공간 재현성 및 방향을 결여 형태 형성의 임의의 과정을 통해 형성된 인공 혈관을 모델링 있지만. 이러한 자기 조립 혈관이 쉽게 장벽 기능 및 장기 혈관 안정성이 엔지니어링 혈관 도전을 포즈, 3D 관 조직 55과 내강의 흐름을 결합하지 않기 때문에 또한, 미세 혈관의 안정성 흐름의 영향은 크게 알려지지 않은 남아있다.
마이크로 유체 시스템은 생화학 및 생물 학적 분석 56,57의 다양한 흐름을 소개하는 실용적이고 유용한 것으로 입증되었습니다. 우리의 접근 방식은 배양 세포를 통해 유체의 흐름을 소개하는 편리한 방법을 제공합니다. 우리는 사용장기 세포 배양을위한 마이크로 (4 일 이주 사이)를 통해 편리하게 아직 안정하고 정확한 유량 제어를 달성하기 위해 고급 원격 제어 주사기 펌프.
3. 칩 세포 배양
PDMS의 마이크로 플라즈마를 이용한 산화 더 단백질 코팅 표면이 친수성 보조 렌더링 표면에 실라 놀 그룹 (SiOH)를 소개합니다. 다른 ECM 단백질은 (피브로넥틴, 젤라틴, 콜라겐) 세포 부착에 대한 검사를했다, 그리고 최상의 결과는 fibronectin의 코팅이 발견되었다. HUVECs는 3 × 10 6 세포 / 시드 8 % 덱스 트란 (70 kDa의)와 보충 문화 미디어 ML의 농도로 제조 하였다. 덱스 트란은 내피의 밀도를 뿌리기에 미세 조정을 가능하게하는 매체의 점도를 증가시킵니다.
합류 단층는 일정한 매체의 흐름에 노출되는 HUVECs 2-4 일 사이에서 개발되었다. 후 세포를 시각화하는 방법세포 배양, 우리는 막 염색과 핵 염색 염료 세포를 라벨, 이러한 염료 낮은 세포 독성 58 전시. 우리는 칩에서 배양 자기편 단일 층으로 세포를 염색. 전체 1X PBS 세척 칩 안에 갇혀 여분의 염료를 방지 할 필요가있다.
요약하면, 리플 로우 포토 레지스트 기술과 PDMS 복제의 조합에 의해 개발 된 멀티 깊이 마이크로 네트워크는 원형의 표면에 근사하고 각 분기의 채널 직경 약 머레이의 법에 순종했습니다. 다른 분기 수준에서 전단 응력의 변화는 제작 된 미세 유체 채널 네트워크 최소화 할 수 있습니다. 또한, 세포 배양의 결과는 내피 세포의 건강 상태를 지적했다. 따라서, 개발 endothelialized 마이크로 - 온 - 칩을 모방 원형 횡단면 다중 분기와 multidepth 마이크로 네트워크를 만들 수있는 신속하고 재현성있는 접근 방식을 제공생체 내 미세 혈관에서의 형상. 절차는 고급 micromanufacturing와 장기, 지속적인 관류 제어뿐만 아니라 고품질의 실시간 영상 기능 미세 혈관 모델을 만들 수있는 마이크로 유체 기술의 고유 한 기능을 사용하는 방법을 보여줍니다. 세포 생물학, 조직 공학, 생체 공학 응용을위한 미세 유체 채널의 증가 유틸리티, endothelialized 마이크로 - 온 - 칩은 미세 혈관 연구를위한 잠재적 인 분석이다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 부분적으로 국립 과학 재단 (NSF 1,227,359)는 각각 국립 과학 재단 (EPS-1003907), 국립 과학 재단 (1007978) 후원 WVU 사전 사무실 및 WVU PSCoR에 의해 자금 WVU EPSCoR 프로그램에 의해 지원되었다. 미세 작업은 WVU 공유 연구 시설 (클린 룸 설비)과 웨스트 버지니아 대학의 칩 연구소 (마이크로 칩 연구소)에 미세 유체 통합 세포 연구로 이루어졌다. 공 촛점 이미징 WVU 현미경 이미징 시설에서 이루어졌다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
- Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
- O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G.
- Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W.
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
