Summary
Een microchannels-on-a-chip platform werd ontwikkeld door de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics. Het endotheel microkanalen platform bootst de driedimensionale (3D) geometrie van in vivo micro-vaatjes, loopt onder gecontroleerde continue perfusie stroom, zorgt voor hoge kwaliteit en real-time beeldvorming en kan worden toegepast voor microvasculaire onderzoek.
Abstract
Inspanningen gericht op het ontwikkelen van in vitro assays voor de studie van microvaatjes omdat in vivo dierstudies zijn tijdrovend, duur en observatie en kwantificering zijn zeer uitdagend. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje hebben beperkingen als die in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie en een continue vloeistofstroom. Met behulp van een combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics, hebben we een multi-diepte cirkelvormige dwarsdoorsnede endotheel microkanalen-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie flow. Een positieve herplaatsbaar fotolak werd gebruikt om een meester mal te fabriceren met een halfronde dwarsdoorsnede microchannel netwerk. Door de afstemming en binding van de twee polydimethylsiloxaan (PDMS) microchannels replvoor bestemde van de meester mal, werd een cilindrische microchannel netwerk gecreëerd. De diameters van de microkanalen kan goed worden gecontroleerd. Bovendien primaire humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) gezaaid in de chip bleek dat de cellen gevoerd het binnenoppervlak van de microkanalen in gecontroleerde perfusie die gedurende een tijdsperiode tussen 4 dagen tot 2 weken.
Introduction
Microvaatjes als onderdeel van het circulatiesysteem, bewerkstelligen de interactie tussen bloed en weefsels, ondersteunen metabolische activiteiten definiëren weefsel micro en spelen een belangrijke rol in vele gezondheids en pathologische omstandigheden. Recapitulatie van functionele microvaatjes in vitro kan een platform voor de studie van complexe vasculaire fenomenen. Echter, conventionele in vitro assays microvaatje, zoals endotheliale celmigratie testen buisvorming endotheliale assays en ratten en muizen aortaring assays, in staat zijn de opnieuw in vivo microvaatjes met betrekking tot driedimensionale (3D) geometrie als continu control 1-8. Studies microvaatjes met dierlijke modellen en in vivo assays, zoals corneale angiogenese assay, kuiken chorioallantoïsmembraan angiogenese assay en Matrigel plug assay, zijn tijdrovend, in hoge kosten, uitdaging met betrekking tot waarneming en kwantificering enethische kwesties 1, 9-13.
Vooruitgang in micromanufacturing en microfluïdische chip technologieën hebben verschillende inzichten mogelijk in biomedische wetenschappen terwijl vermindering de experimentele hoge kosten en complexiteit van de dieren in vivo studies 14, zoals gewoon strak gecontroleerde biologische omstandigheden en dynamische vloeibare milieus, die niet zou mogelijk met conventionele technieken macroschaal.
Hier presenteren we een aanpak om een endotheel construeren microchannels-on-a-chip, die de 3D-geometrie van de in vivo micro-vaatjes nabootst en draait onder gecontroleerde continue perfusie stroom door gebruik te maken van de combinatie van fotolithografische reflowable fotolak techniek, zachte lithografie, en microfluidics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fotolithografie Fabrication van Photoresist Master Mold
Het volgende protocol toont het proces om de microkanalen fabriceren met een diameter tussen 30-60 um. Een microkanaal komen met een kleinere diameter (kleiner dan 30 urn), een spin-coating fotoresist nodig.
- Breng de reflow fotolak van de koelkast bij 4 ° C tot de cleanroom 24 uur voor gebruik en laat het opwarmen tot kamertemperatuur.
- Schoon een silicium wafer en bak het gedurende een uur bij 150 ° C om deze te dehydrateren. De uitdroging wordt de fotoresist voorkomen kan het siliciumsubstraat.
- Spin-laag de eerste laag fotolak met het volgende recept:
| Stap | Tijd (seconden) | Toerental (tpm) | Versnelling |
| 1 | 2 </ Td> | 300 | hoogst |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | hoogst |
| 4 | 60 | 600 | hoogst |
| 5 | 10 | 500 | hoogst |
| 6 | 10 | 600 | hoogst |
- Bak dan de wafel op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 110 ° C gedurende 90 sec. Na het zacht bakken de dikte van de fotoresist wordt 20-30 urn.
- Spin laag een tweede laag fotolak volgens dezelfde receptuur voor de eerste laag.
- Zachte bak de wafer opnieuw door het op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 110 ° C gedurende 90 sec. Hierna soft bake de dikte van de fotoresist wordt 40-60 urn.
- Genereren van positieve meester patronen door het blootstellen van de photoresist aan UV-licht met een bestralingsdosis van 14.500 mJ / cm 2 door middel van een film masker.
- Verdun de ontwikkelaar met gedeïoniseerd (DI) water (1:2 (v / v)). Herhaaldelijk spoelen de wafer in de oplossing totdat het patroon volledig is ontwikkeld. Was daarna de wafer met DI-water en droog het met behulp van stikstofgas.
- Opnieuw: Plaats de wafer op een verwarmingsplaat met een temperatuur van 120 ° C gedurende 4 min en deksel met een glazen petrischaal om oplosmiddelverdamping te voorkomen. Verwijder de wafer uit een verwarmingsplaat en laat afkoelen tot kamertemperatuur. De fotoresist dikte na reflow is gewoonlijk 50-60 micrometer.
2. Zachte Lithografie Fabrication van PDMS Microchannel Network
- Bereid polydimethylsiloxaan (PDMS) oplossing in de gewichtsverhouding van 10:01 (basis: verharder) en meng het grondig met een centrifugale planetaire menger.
- Wierp de PDMS oplossing op de opnieuw geplaatste fotolak meester mal. Plaats de gegoten PDMS in een exsiccator gedurende 15 minuten te ontgassen. Gebruik stikstofgas om alle resterende luchtbellen indien nodig te verwijderen.
- Bak de PDMS in een oven bij een temperatuur van 60 ° C gedurende 3 uur om deze te genezen. Verwijder vervolgens de uitgeharde PDMS laag van de meester mal.
- Gebruik een scherp puncher met inlaat / uitlaat gaten te creëren door het ponsen van gaten in het kanaal netwerk. Reinig het oppervlak van de PDMS met stikstofgas.
- Behandel twee PDMS lagen met zuurstofplasma gedurende 30 seconden in een plasma cleaner bij een werkdruk van 4,5 x 10 -2 Torr en een zuurstof stroomsnelheid van 3,5 m 3 / min. Breng daarna de oppervlakken van de PDMS handmatig onder een optische microscoop. Gebruik een druppel water eventueel een betere controle van de uitlijning.
- Bak de inrichting in een oven bij 60 ° C gedurende 30 min tot permanente verbinding te verkrijgen.
3. HUVEC Cultuur en zaaien in de Chip
- Cultuur de HUVEC door kweekmedium met L-glutamine, aangevuld met 10% foetaal bovine serum (FBS). Voor the experiment doorgangen tussen 2 en 5 werden gebruikt.
- Zodra de HUVEC confluent zijn, tellen de cellen en oogst ze door eerst spoelen van de cellen met HEPES gebufferde zoutoplossing (HEPES-BSS), en vervolgens behandelen van de cellen met trypsine / EDTA en incubeer gedurende 2-6 minuten bij 37 ° C. Na de behandeling met trypsine is voltooid, neutraliseren de trypsine / EDTA met trypsine neutraliserende oplossing. Centrifugeer en schorten de cellen in kweekmedium met 8% dextran om ze te verzamelen. Dextran werd gebruikt om het medium viscositeit te verhogen om te helpen bij hogere cellulaire zaaien en bevestiging.
- Behandel het apparaat met zuurstofplasma gedurende 5 min bij een werkdruk van 4,5 x 10 -2 Torr en een zuurstof stroomsnelheid van 3,5 m 3 / min. Vervolgens laadt het apparaat met DI-water en behandelen met UV-licht voor 8 uur in een laminaire bioveiligheid kap voor sterilisatie.
- Een dag voor de cellen klaar zijn, was het apparaat met 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS) dan jas met fibronectine (100 ug / ml, diluted met 1x PBS) en incubeer in de koelkast bij 4 ° C overnacht.
- Na de fibronectine coating, wast het apparaat met 1x PBS vervolgens te vullen met kweekmedium. Incubeer de inrichting bij een temperatuur van 37 ° C gedurende 15 minuten.
- Plaats de HUVEC cellen in 8% dextran kweekmedium met een celconcentratie van 3-4 x 10 6 cellen / ml. Plaats een 20 ul druppel cellen bij een inlaat van het toestel en kantelen om de cellen te introduceren in de microfluïdische kanaal. Na 15-20 min de cellen beginnen te hechten aan de zijwanden van de kanalen. Draai het apparaat elke 15 minuten tot een gelijkmatige verdeling van de cellen te creëren. Indien nodig kan extra lading worden uitgevoerd.
4. Langdurige perfusie Setup
Na 5-6 uur van statische cultuur, zal de bijgevoegde HUVECs beginnen om volledig uit te strekken. Opzetten perfusie met behulp van een op afstand bestuurbare spuit pompsysteem met een gestage stroom van 10 pl / uur. Perfusie kan worden aangepast fof een hoger debiet, en kan duren voor een periode van 4 dagen tot 2 weken.
5. Cel kleuring en Microscoop karakterisering
- Wanneer de cellen te bereiken samenvloeiing in het apparaat, ten eerste, was het apparaat met 1x PBS om grondig te verwijderen het medium. Vervolgens laadt het apparaat met rode kleurstof verdund met verdunner (4 pl-1 ml). Laad de kleurstof vergelijkbaar met de cel laadproces. Incubeer het apparaat in het donker gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en daarna wassen het apparaat kweekmedium kleuring stoppen. Lange incubatie van de kleurstof kan cellulaire toxiciteit en disadhesion veroorzaken.
- Laad het apparaat met blauwe kleurstof verdund met 1x PBS (2 druppels per ml). Incubeer in het donker gedurende 5 min bij kamertemperatuur geroerd en daarna grondig het apparaat met 1x PBS.
- Onderzoek de cel kleuring onder een omgekeerde optische microscoop. Als de kleuring was goed, laadt de microkanalen met vaststelling medium (3,5% paraformaldehyde verdund met 1x PBS), vervolgens onderdompelenhet apparaat bij de vaststelling van middelgrote en volledig bedekken met aluminiumfolie. Bewaar het toestel in de koelkast bij een temperatuur van 4 ° C zodat het apparaat niet uitdroogt en fotobleken. De vaste inrichting is nu klaar voor confocale beeldvorming, die kan worden uitgevoerd door een laser scanning confocale microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Onze benadering van de multi-diepte microkanaal netwerk vervaardigen bootst de complexe 3D geometrieën van in vivo microvaatjes, waarbij de microkanalen afgeronde doorsneden 15. Bovendien, de diameters van de ouder vertakkende kanalen en dochter kanalen ongeveer gehoorzamen Murray wet handhaven de fluïdumstroom op een vereist niveau, zodat de totale kanaal weerstand laag en stroomsnelheden zijn gelijk voor het gehele netwerk 16-18. De procedure en de resultaten voor de vervaardiging van een halfronde fotoresist meester schimmel en een cirkelvormige dwarsdoorsnede PDMS microkanaal netwerk werden aangetoond in Film 1, figuur 2 en Film 2 respectievelijk. De geometrische eigenschappen van het PDMS microkanaal netwerk werden gekarakteriseerd en in figuur 2. Onze resultaten tonen aan dat de fotolak reflow-techniek multi-diepte vertakking kanaal netwerken kunnen creëren ina handiger aanpak door fotolak reflow technieken, en laat het ontwerpen van de microvasculaire biomimetic systemen die ongeveer gehoorzamen Murray's Law.
In vele in vitro modellen, zijn vasculaire cellen normaal gekweekt op vlakke platen, filters of deze substraten bekleed met hydrogels. Onder deze omstandigheden de microvessels worden willekeurig gegenereerd door cellulaire zelf-assemblage. Bovendien conventionele testen hebben inherente moeilijkheden om een constante stroom over endotheelcellen. Het ontbreken van een langdurige en continue doorstroming verhindert de mogelijkheid om de stabiliteit van endotheel monolaag passende barrièrefunctie te handhaven. In ons model, het voordeel van de toepassing van microfluidics is het gemak voor de toegang vloeistof en controle (variërende debieten, duur en patronen), alsook het wegwerken van afval. We tonen de processen voor het primaire humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) zaaien in de microkanalen en stel ting een langdurige vloeistof perfusie-systeem voor celkweek (Figuur 3). Bovendien wordt, gezien de complexe geometrieën van in vivo microvasculature, real-time monitoring van die kleine schepen is moeilijk. De ontwikkelde PDMS gebaseerde chip biedt goede optische eigenschappen en zorgt voor een hoge kwaliteit en real-time beeldvorming van het endotheel microkanalen. (Figuren 4 en Movie 3)
Film 1. Schematische manschap voor fotoresist meester mallen. Aanvankelijk een vooraf gereinigde siliciumsubstraat werd bereid. De reflow positieve fotoresistlaag werd gespincoat op het siliciumsubstraat en is gebakken en gedroogd. De fotoresist werd blootgesteld aan UV-licht door een masker gevormd, en vervolgens het gevormde microkanalen ontwikkeld. Een halfronde dwarsdoorsnede microkanaal netwerk is ontstaan na de reflow bij 120 ° C gedurende 4 minuten.movie1.wmv "target =" _blank "> Klik hier om de film te bekijken.
Figuur 1. SEM toont de ontwikkelde fotoresist a) voor reflow;. B) na reflow, c) gevormd PDMS de dwarsdoorsnede van de resist voor het opnieuw vloeibaar maken, het beeld toont een rechthoekige dwarsdoorsnede, d) gegoten PDMS met een halfronde doorsnede van de resist na het opnieuw vloeibaar; De dwarsdoorsnede na reflow werd door het oorspronkelijke afmeting ontwerp van de patroon en vloeitemperatuur. (Overgenomen met toestemming van Referentie 15). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Movie 2. Het schema fabricage procedures voor cilindrische microchannel netwerk in PDMS. Een PDMS oplossing werd gegoten op de fotoresist matrijs en gehard in de oven bij een temperatuur van 60 ° C gedurende 3 uur. Twee identieke uitgeharde PDMS lagen, die elk een halfcirkelvormige dwarsdoorsnede microkanaal netwerk werden uitgelijnd en aan elkaar gebonden aan microkanalen vormen met cirkelvormige dwarsdoorsneden. Klik hier om film te bekijken .
Figuur 2. a) Een uitgelijnd en gebonden cilindrische microkanaal netwerk in PDMS. bd) Circulaire doorsneden van PDMS mallen laten kanaal afmetingen bij elke vertakking niveau (1-1, 2-2, en 3-3 '). Bovendien zijn deze cijfers blijkt het creëren van een multibranching en multidepth cirkelvormige dwarsdoorsnede microfluïdische channel netwerk.
page = "altijd"> 
Figuur 3. Schematische weergave van de lange termijn perfusie door de chip met behulp van een op afstand bedienbare spuitpomp.
Figuur 4. Microscopie beelden met behulp van fluorescerende celmembraan kleurstof (rood) en celkernen kleurstof (blauw) laten zien dat de HUVECs de binnenkant van een cilindrische microchannel netwerk op verschillende vertakking regio. A) Top, b) Midden-en c) Bottom. D) beeld confocale microscopie toont de cirkelvormige dwarsdoorsnede van HUVEC langs het kanaal netwerk. Schaal bars: 100 micrometer.
Film 3. Confocal film toont de cel voering langs de cirkelvormig kanaal netwerk.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "target =" _blank "> Klik hier om de film te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1. Meester schimmel fabricage
Een van de ontwerpen en de leidende beginselen voor vasculaire morphometry staat bekend als Murray's wet 16, waarin staat dat de verdeling van het schip diameters in het gehele netwerk wordt beheerst door minimale energie overweging. Het bepaalt ook dat de kubus van de diameters van een ouder schip op een vertakking is gelijk aan de som van de kubussen van de diameters van de dochter schepen ( 
) 19 Daarnaast heeft Poiseuille wet gebruikt om de grootte van de schuifspanning schatten meeste vasculatuur 
. waarbij1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/> is de hemodynamische schuifspanning, μ is de viscositeit van het bloed, Q is het debiet, en R de straal van de vaartuig 20,21. Voor symmetrische vertakkingen, een belangrijke consequentie wettelijke basis Murray en Poiseuille wet is dat de wandschuifspanning constant gedurende het vasculaire netwerk blijft. Zo een vervaardigde symmetrisch kanaal microfluïdische netwerk met cirkelvormige dwarsdoorsneden, als het kanaal afmetingen bij vertakkingen gehoorzamen Murray's wet, moet de shear stress ervaren door de endotheelcellen constant op verschillende vertakkende kanalen.
Veel microfabricage technieken en procedes zijn toegepast op de vervaardiging van microkanalen voor vasculaire cellen 22-25, maar de resulterende microkanalen geleid rechthoekig, vierkant of trapeziumvormige dwarsdoorsneden van kanalen. De rechthoekige dwarsdoorsneden van kanalen zijn coneerd met scherpe bochten en abrupte overgangen bij vertakkingen, die kan opleggen uiteenlopende vloeistof schuifspanningen en niet-fysiologische geometrieën op cellen in verschillende kanalen posities, hetgeen resulteert in variaties in cel fysiologie 26,27.
Een fotoresist reflow proces resulteert in een afgeronde kanaal profiel omvat twee procedures, 1) het smelten van het gevormde fotoresist en de vloeistof tegen oppervlakken worden getrokken in een vorm die de energie van het systeem minimaliseert 28,29 en 2) een koel-en stolling fase volgt het smeltproces. De vormen van de opnieuw geplaatste kanalen worden goed benaderd door een semi-cilindrisch oppervlak. Gevolgd door opnieuw geplaatste meester schimmel fabricage, werd een standaard zachte lithografie benadering gebruikt om de PDMS microfluïdische kanaal netwerk fabriceren met een ronde doorsnede. Onze resultaten toonden aan dat de fotolak reflow-techniek multi-diepte vertakking microchannel netwerken kunnen creëren op een meer Straightt voorwaartse benadering, kunnen we microvasculaire biomimetische systemen die ongeveer gehoorzamen Murray Wet en bootsen de geometrie van in vivo microvasculature, zodat de totale kanaal weerstand laag en de schuifspanning variaties op verschillende vertakking niveaus kunnen worden geminimaliseerd in de gefabriceerde microfluïdische kanaal netwerk.
De fysiologische bloed microvaatjes een ruwweg cirkelvormige doorsnede te nemen met een straal tussen 30-300 micrometer 30. De afmetingen van de aangetoonde microkanaal netwerk in dit document werden gevarieerd ongeveer 60 urn tot 100 urn op verschillende niveaus vertakking. Om microkanalen met verschillende waaier van diameters voor het nabootsen van in vivo microvessels fabriceren, raden we aan om enkele gesponnen layer reflow gebruiken weerstaan (beperkt tot 30 pm) of andere lagere viscositeit weerstaat. Een microkanaal met een grotere diameter (30-60 urn), een dubbel-bekledingswerkwijze toegepast om dikkere fotolaklaag krijgen15. Extra spin-coating bovenstaande twee lagen worden vermeden, teneinde uniforme filmdikte, wat kan leiden tot een onjuiste dosering blootstelling. Bij een laagdikte boven 60 urn, zijn andere hogere viskeuze reflow lichtgevoelige aanbevolen.
In een ideale toestand, te fabriceren tegen een matrijs met een halfronde dwarsdoorsnede, kan de filmdikte aanvankelijk bepaald door het geven van een gewenste breedte en de brandpuntsafstand van het microkanaal zoals 
, Waarbij H de vereiste gesponnen laagdikte, r de helft van de kanaalbreedte, R is de constante kromtestraal, h de centrale hoogte van de kromming, en E is de verhouding van weerstand volumes van de microkanaal voor en na reflowing 31. Voor een cilindrisch oppervlak van een bepaalde breedte van microkanaal, een bepaald volume van de resist weerwenste. Toch hebben verschillende parameters gemeld van invloed de opnieuw geplaatste fotoresist en maakt de resulterende gootprofielen ingewikkelder, zoals kritische hoek en grens beweging tussen de fotoresist en het vaste substraat, materieel verdamping tijdens reflow bakken, temperatuur en timing voor het reflow-proces, ontgassing, substraat uniformiteit, en weerstaan eigenschappen 32-34. Bijvoorbeeld kan de vloeitemperatuur en timing tot een volumeverandering waardoor de grens beweging en dus variëren van de kritische hoek en laatste reflowed resistprofiel 33. Zoals gemeld door onze eerdere werk 15, het reflow proces daalde de kanaalbreedtes met 2% gemiddeld vanwege fotolak volume kortingen en grens beweging. Bovendien, het volume voor het verkrijgen van een cilindrisch oppervlak moet rekening houden met het effect van materiaal verdamping tijdens de reflow werkwijze 35,36. Als cilindrische oppervlakken met verschillende radii zijn vereist dooreen microkanaal netwerk moet de breedte van de microkanalen variëren, resulterend in variaties van de hoeveelheden in verschillende gebieden in het netwerk 15. Om succesvol fabriceren van een cilindrisch kanaal netwerk met verschillende diameters, het weerstaat breedtes / volumes, reflow temperaturen en de timing, kritische hoeken, grens beweging, verzetten viscositeiten en spin coating protocollen, en substraat eigenschappen moeten worden overwogen en getest.
2. Langdurige celcultuur
Het belang van flow en de bijbehorende wandschuifspanning is goed herkend bij het reguleren van endotheliale biologie. Dit is gezien in gebieden zoals het induceren van veranderingen in cel vorm en oriëntatie, secretie en organisatie, proliferatie en differentiatie, intracellulaire signalering, cytoskelet eiwitproductie en genexpressie, vat rijping en structuur, en barrièrefuncties 37-47. De huidige in-vitro methoden voor het vormen van endothelial buizen over het algemeen rekenen op endotheelcellen '(EC) zelforganisatie met of zonder mesenchymale cellen in de extracellulaire matrix (ECM) (type I collageen, fibrine, of Matrigel) 48-54. Hoewel deze culturen hebben met succes gemodelleerd verschillende microvasculaire gedrag, de kunstmatige schepen gevormd door een willekeurig proces van morfogenese missen de gewenste ruimtelijke reproduceerbaarheid en oriëntatie. Daarnaast is de invloed van stroming op microvasculaire stabiliteit blijft grotendeels onbekend omdat deze zelf-geassembleerde schepen niet gemakkelijk luminale stroom combineren met een 3D buisvormige organisatie 55, die een uitdaging om technische bloedvaten barrièrefuncties en langdurige vasculaire stabiliteit hebben.
Microfluïdische systemen praktisch gebleken en nuttig voor de invoering stromen van verschillende biochemische en biologische analyse 56,57. Onze aanpak biedt een gemakkelijke manier om de vloeistofstroom te introduceren in de gekweekte cellen. We gebruikten eengeavanceerde afstandsbediening injectiepomp een gunstige en toch stabiele en nauwkeurige flow control te bereiken via de microkanalen voor de lange termijn celkweek (tussen 4 dagen en 2 weken).
3. Celcultuur in de chip
Plasma-geassisteerde oxidatie van de PDMS microkanalen introduceert silanolgroepen (SiOH) op de oppervlakken die het oppervlak hydrofiel en helpt verder eiwit coatings maakt. Verschillende ECM-eiwitten (fibronectine, gelatine en collageen) getest op celhechting, en het beste resultaat bleek fibronectine coating. De HUVEC's werden bereid bij een concentratie van 3 x 10 6 cellen / ml in kweekmedium aangevuld met 8% dextran (70 kDa) te zaaien. Dextran verhoogt de viscositeit van de media om precieze controle mogelijk op zaaien dichtheid van EC.
Een confluente monolaag werd ontwikkeld tussen 2-4 dagen na de HUVEC wordt blootgesteld aan een constante mediumstroom. Om de cellen na het visualiserencelcultuur, gelabeld we cellen met membraankleuring en kernen vlekken kleurstoffen, deze kleurstoffen vertoonden lagere cytotoxiciteit 58. We gekleurd de cellen als een hechtende monolaag gekweekt in de chip. Een volledige 1x PBS wassen moet extra kleurstoffen opgesloten in de chip te voorkomen.
Samenvattend, door de combinatie van reflow fotoresist techniek en PDMS replicatie, werd het ontwikkelde multi-diepte microkanaal netwerk benaderd door een cirkelvormig oppervlak en het kanaal diameter van beide vertakking ongeveer gehoorzamen Murray's wet. De schuifspanning variaties op verschillende niveaus vertakking kan worden geminimaliseerd in de gefabriceerde microfluïdische kanaal netwerk. Bovendien, de resultaten van celkweek aangegeven de gezonde toestand van de endotheelcellen. Zo is de ontwikkelde endotheel microkanalen-on-a-chip zorgt voor een snelle en reproduceerbare benadering cirkelvormige dwarsdoorsnede multi-vertakking en multidepth microkanaal netwerken, die bootst het creërengeometrie van in vivo microvaatjes. De procedure illustreert het gebruik van de unieke mogelijkheden van geavanceerde micromanufacturing en microfluïdische technologieën om een microvasculatuur model met een langdurige, continue perfusie controle alsmede hoge-kwaliteit en real-time beeldvorming vermogen te creëren. Met de toenemende nut van microfluïdische kanalen voor celbiologie, tissue engineering, en bio-ingenieur toepassingen, het endotheel microkanalen-on-a-chip is een mogelijke test voor microvasculaire onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de National Science Foundation (NSF 1227359), WVU EPSCoR programma gefinancierd door de National Science Foundation (EPS-1003907), WVU ADVANCE kantoor gesponsord door de National Science Foundation (1007978), en WVU PSCoR, respectievelijk. De microfabrication werk werd gedaan in WVU Shared Research Facilities (cleanroom-faciliteiten) en Microfluïdische Integratieve Cellular Research on Chip Laboratory (microchip Lab) bij Universiteit van West Virginia. De confocale beeldvorming werd gedaan bij WVU Microscope Imaging Facility.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
- Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
- O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G.
- Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W.
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
