Summary
En microchannels-on-a-chip platform blev udviklet af en kombination af fotolitografisk reflowable photoresist teknik, blød litografi og mikrofluidik. Den endothelialized microchannels platform efterligner den tredimensionelle (3D) geometri in vivo mikrokar kører under kontrollerede kontinuerlig perfusion flow, giver mulighed for høj kvalitet og real-time scanning, og kan anvendes til microvascular forskning.
Abstract
Indsatsen har været fokuseret på at udvikle in vitro assays til studiet af mikrokar fordi in vivo dyreforsøg er mere tidskrævende, dyrt og observation og kvantificering er meget udfordrende. Imidlertid konventionel in vitro mikrokar assays har begrænsninger, når det repræsenterer in vivo mikrokar med hensyn til tredimensionale (3D) geometri og tilvejebringe kontinuerlig fluidstrømning. Ved hjælp af en kombination af fotolitografisk reflowable photoresist teknik, blød litografi og MicroFluidics, har vi udviklet en multi-dybde cirkulære tværsnit endothelialized microchannels-on-a-chip, som efterligner den 3D-geometri in vivo mikrokar og kører under kontrollerede kontinuerlig perfusion flow. En positiv reflowable fotoresist blev anvendt til at fremstille en master støbeform med et halvcirkelformet tværsnit mikrokanalplade netværk. Ved tilpasning og limning af de to polydimetylsiloxan (PDMS) microchannels REPLlemstore fra master formen blev en cylindrisk mikrokanalplade netværk oprettet. De diametre microchannels kan være velkontrolleret. Desuden viste primære humane navlevene endotelceller (HUVEC'er) podet inde i chippen, at cellerne foret den indvendige overflade af mikrokanaler under kontrollerede perfusion varig i et tidsrum mellem 4 dage til 2 uger.
Introduction
Mikrokar, som en del af cirkulationssystemet, medierer samspillet mellem blod og væv støtte metaboliske aktiviteter, definere væv mikromiljø, og spiller en afgørende rolle i mange sundheds-og patologiske tilstande. Sammenfatning af funktionelle mikrokar in vitro kunne give en platform for studiet af komplekse vaskulære fænomener. Imidlertid konventionel in vitro mikrokar assays, såsom endotelcellemigration assays, endotelceller rørdannelse assays og rotter og mus aortaringen assays, er i stand til at genskabe in vivo mikrokar med hensyn til tredimensionale (3D) geometri og kontinuerlig strøm kontrol 1-8. Undersøgelser af mikrokar anvendelse af dyremodeller og in vivo assays, såsom hornhinde angiogenese assay, kyllingechorioallantoinmembranen membran angiogenese assay, og Matrigel plug assay, er mere tidskrævende, høj i pris, udfordrende med hensyn til observation og kvantificeringer ogrejser etiske spørgsmål 1, 9-13.
Fremskridt i micromanufacturing og mikrofluid chip teknologier har muliggjort en bred vifte af indsigt i biomedicinske videnskaber, mens begrænse de høje eksperimentelle omkostninger og kompleksiteter i forbindelse med dyr og in vivo studier 14, såsom let og stramt kontrollerede biologiske forhold og dynamiske fluidisk miljøer, hvilket ikke ville have været muligt med konventionelle Makroskalaplacering teknikker.
Her præsenterer vi en tilgang til at konstruere en endothelialized microchannels-on-a-chip, som efterligner den 3D-geometri in vivo mikrokar og kører under kontrollerede kontinuerlig perfusion flow ved hjælp af en kombination af fotolitografisk reflowable photoresist teknik, blød litografi og mikrofluidik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fotolitografi Fabrikation af Fotoresist Master Mold
Følgende protokol viser processen for at fremstille de mikrokanaler med diametre på mellem 30-60 um. At få en mikrokanalplade med en mindre diameter (mindre end 30 um), en enkelt spin-coating af fotoresist er nødvendig.
- Overfør reflow fotoresist fra køleskabet ved 4 ° C til renrummet 24 hr før brug og lad den varme op til stuetemperatur.
- Rens en siliciumskive og bage det i en time ved 150 ° C for at tillade det at dehydrere. Dehydrering vil hjælpe fotoresist vedhæftning til silicium substrat.
- Spin-coat det første lag af fotoresist hjælp af følgende opskrift:
| Trin | (Sekunder) | Hastighed (rpm) | Acceleration |
| 1 | 2 </ Td> | 300 | højest |
| 2 | 10 | 0 | |
| 3 | 3 | 300 | højest |
| 4 | 60 | 600 | højest |
| 5 | 10 | 500 | højest |
| 6 | 10 | 600 | højest |
- Derefter bage wafer på en varmeplade med en temperatur på 110 ° C i 90 sek. Efter den bløde bage tykkelsen af fotoresist bliver 20-30 um.
- Spin pels et andet lag af fotoresist efter samme opskrift anvendes til det første lag.
- Blød bage skiven igen ved at placere den på en varmeplade med en temperatur på 110 ° C i 90 sek. Efter denne bløde bage tykkelsen af fotoresist bliver 40-60 um.
- Skabe positive master-mønstre ved at udsætte photoresist for UV-lys med en eksponering dosis af 14.500 mJ / cm 2 ved hjælp af en film maske.
- Fortynd udvikleren med deioniseret (DI) vand (1:2 (v / v)). Skyl wafer gentagne gange i opløsningen, indtil mønsteret er fuldt udviklet. Vask derefter wafer med DI vand og tør det ved hjælp af kvælstof gas.
- Reflow: Sted skiven på en varmeplade med en temperatur på 120 ° C i 4 min og dækkes med et glas petriskål at forhindre fordampning af opløsningsmiddel. Fjern pladen fra varmepladen og lad den afkøle til stuetemperatur. Fotoresist tykkelse efter reflow vil være 50-60 um.
2.. Blød Litografi Fabrikation af PDMS mikrokanalplade Netværk
- Forbered polydimethylsiloxan (PDMS) opløsning ved vægtforhold på 10:1 (base: hærder) og bland grundigt med en planetarisk centrifugalblanderen.
- Kast PDMS opløsningen på ombrudt photoresist mester mug. Placer støbt PDMS i en ekssikkator i 15 min til afgasse. Brug nitrogengas for at fjerne eventuelle resterende bobler evt.
- Bage PDMS i en ovn ved en temperatur på 60 ° C i 3 timer for at gøre det muligt at helbrede. Derefter fjerne det hærdede PDMS lag fra master formen.
- Brug en skærpet puncher at skabe indløb / udløb huller ved hulning i kanalnet. Rengøre overfladen af PDMS anvendelse af nitrogengas.
- Behandle to PDMS lag med oxygenplasma i 30 sek inde i en plasma renere ved et driftstryk på 4,5 x 10 -2 Torr og en oxygen-strømningshastighed på 3,5 m 3 / min. Derefter justeres overflader PDMS manuelt under et optisk mikroskop. Brug en dråbe vand hvis det er nødvendigt for en bedre styring af tilpasningen.
- Bag enheden i en ovn ved 60 ° C i 30 min for at opnå permanent binding.
3.. HUVEC Kultur og såning i Chip
- Kultur de HUVEC'er med dyrkningsmedium med L-glutamin suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). For the eksperiment passager mellem 2 og 5 blev anvendt.
- Når HUVEC'er er sammenflydende, tælle cellerne og høste dem ved først skylning af cellerne med HEPES bufret saltvandsopløsning (HEPES-BSS), og derefter behandle cellerne med trypsin / EDTA og inkuberes i 2-6 min ved 37 ° C. Efter trypsinisering er fuldført, neutralisere trypsin / EDTA med trypsin neutraliserende opløsning. Centrifuger og suspendere cellerne i dyrkningsmedium med 8% dextran til at indsamle dem. Dextran blev anvendt til at forøge middel viskositet til støtte i bedre cellepodning og fastgørelse.
- Behandl enhed med oxygenplasma i 5 minutter med et driftstryk på 4,5 x 10 -2 Torr og en oxygen-strømningshastighed på 3,5 m 3 / min. Derefter indlæse enheden med DI vand og behandle med UV-lys i 8 timer i en laminar biosikkerhed hætte til sterilisering.
- En dag før cellerne er klar, vaske enhed med 1x phosphatpufret saltvand (1x PBS) og derefter frakke med fibronectin (100 ug / ml, diludloddet med 1x PBS) og inkuberes i køleskab ved 4 ° C natten over.
- Efter fibronektin belægning, vaske enhed med 1x PBS derefter indlæse med dyrkningsmedium. Inkuber enheden ved en temperatur på 37 ° C i 15 min.
- Indlæse HUVEC celler i 8% dextran dyrkningsmedium med en cellekoncentration på 3-4 x 10 6 celler / ml. Placer en 20 ul dråbe af celler ved et indløb af enheden og vippe den til at introducere celler i mikrofluid kanal. Efter 15-20 min vil cellerne begynde at knytte til sidevæggene af kanalerne. Drej enheden hver 15 min for at skabe en mere ensartet fordeling af celler. Hvis det er nødvendigt, kan yderligere belastning udføres.
4.. Langsigtet Perfusion Setup
Efter 5-6 timers statisk kultur, vil de vedhæftede HUVEC'er begynde til fuldt spredt ud. Opsæt perfusion med en fjernstyret sprøjtepumpe system med en konstant strøm af 10 gl / time. Perfusion kan justeres feller en højere strømningshastighed, og kan vare i et tidsrum på mellem 4 dage til 2 uger.
5.. Cellefarvning og Microscope karakterisering
- Når cellerne når konfluens inde i enheden, for det første, vaske enhed med 1x PBS til grundigt at fjerne mediet. Derefter indlæse enheden med rød farve fortyndet med diluent (4 gl-1 ml). Indlæse farvestof svarende til cellen indføringsprocedure. Inkuber enheden i mørke i 5 minutter ved stuetemperatur, og derefter vaske enheden med dyrkningsmedium at stoppe farvning. Lang inkubation af farvestoffet kan forårsage cellulær toksicitet og disadhesion.
- Indlæse enhed med blåt farvestof fortyndes med 1x PBS (2 dråber pr ml). Der inkuberes i mørke i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter vaskes grundigt enheden med 1x PBS.
- Undersøg cellefarvning under et inverteret optisk mikroskop. Hvis farvningen var god, indlæse microchannels med fastsættelse medium (3,5% paraformaldehyd fortyndet med 1x PBS), og derefter dykkeenheden i fastsættelsen medium og helt dække det med alufolie. Opbevares i køleskabet ved en temperatur på 4 ° C for at forhindre, at enheden tørrer ud og fotoblegning. Den faste enhed er nu klar til konfokal billeddannelse, hvilket kan gøres ved laserscanning konfokal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores tilgang til at fremstille multi-dybde mikrokanalplade netværk efterligner komplekse 3D geometrier af in vivo mikrokar, hvor mikrokanalerne har afrundede tværsnit 15.. Derudover diametrene af moder forgrenende kanaler og datter kanaler omtrent adlyde Murray lov til opretholdelse af fluidumstrømmen på et krævede niveau, så den samlede kanal modstanden er lav og strømningshastigheder er mere ensartet i hele netværket 16-18. De processer og resultater for fremstilling af en halvcirkelformet photoresist mester mug og en cirkulær tværsnit PDMS mikrokanalplade nettet blev demonstreret i Movie 1, figur 2, og Movie 2, hhv. De geometriske kendetegn PDMS mikrokanalplade net blev karakteriseret og vist i figur 2. Vores resultater viser, at den photoresist reflow teknik kan skabe flere dybdegående forgrening kanal netværk ina mere praktisk tilgang ved fotoresistbelagte reflow teknikker og tillade designe mikrovaskulære biomimetiske systemer, som ca adlyde Murray lov.
I mange in vitro-modeller, der karcellerne normalt dyrket på plane plader, filtre eller disse substrater belagt med hydrogeler. Under disse betingelser mikrokarrene er tilfældigt genereret af cellulær selvsamling. Desuden har konventionelle assays iboende vanskeligheder ved at opnå en konstant strøm i løbet af endotelceller. Manglen på en langsigtet og kontinuerlig mediestrømmen forhindrer evnen til at opretholde stabiliteten af endotelcelle farves med passende barriere funktioner. I vores model, er fordelen ved anvendelse microfluidics bekvemmelighed for væske adgang til og kontrol (varierende strømningshastigheder, varighed og mønstre) samt at slippe af med affald. Vi viser processerne for primære humane navlevene endotelceller (HUVEC'er) såning i microchannels og sæt delse en langsigtet væske perfusion system til cellekultur (figur 3). På grund af de komplekse geometrier af in vivo microvasculature er real-time overvågning af disse små fartøjer vanskelig. Det udviklede PDMS baserede chip tilbyder gode optiske egenskaber og giver mulighed for høj kvalitet og real-time scanning af endothelialized microchannels. (Fig. 4 og Movie 3)
Movie 1. Skematisk fabrikation procedurer for fotoresist master-forme. Indledningsvis blev en forrensede silicium substrat forberedt. Den positive reflow fotoresistlag var spin-coatet på siliciumsubstratet og blev bagt og tørret. Fotoresist blev udsat for UV-lys gennem en mønstret maske, og derefter blev de mønstrede microchannels udvikles. En halvcirkelformet tværsnit mikrokanalplade netværk blev oprettet efter reflow ved 120 ° C i 4 min.movie1.wmv "target =" _blank "> Klik her for at se filmen.
Figur 1. SEM viser den udviklede fotoresist a) inden reflow,. B) efter reflow c) støbt PDMS viser tværsnittet af modstå før reflowing, billedet viser et rektangulært tværsnit d) støbt PDMS viser en halvcirkelformet tværsnit af modstå efter reflowing, Tværsnittet efter reflow blev kontrolleret af den oprindelige dimension design af mønster og reflow temperatur. (Gengivet med tilladelse fra reference 15). Klik her for at se større figur .
Movie 2. De skematiske fabrikation procedurer for cylindrisk mikrokanalplade netværk i PDMS. En PDMS opløsning blev støbt på den fotoresist mug og hærdes i ovnen ved en temperatur på 60 ° C i 3 timer. To identiske hærdede PDMS lag, som hver har et halvcirkelformet tværsnit mikrokanalplade netværk, blev tilpasset og bundet sammen til dannelse mikrokanaler med cirkulære tværsnit. og se film .
Figur 2. a) En linie og bundet cylindrisk mikrokanalplade netværk i PDMS. bd) Cirkulære tværsnit af PDMS forme viser kanal dimensioner på hvert forgrening niveau (1-1 '2-2' og 3-3). Desuden viser disse tal oprettelsen af et multibranching og multidepth cirkulært tværsnit mikrofluid kanal netværk.
page = "altid"> 
Figur 3. Skematisk diagram, der viser den langsigtede perfusion gennem chip bruger en fjernbetjent sprøjtepumpe.
Figur 4.. Mikroskopi billeder ved hjælp af fluorescerende cellemembran farvestof (rød) og cellekerner farvestof (blå) viser, at HUVEC'er linje den indre overflade af et cylindrisk mikrokanalplade netværk på forskellige forgreninger regioner. A) Øverst, b), Mellemøsten, og c) Bund. D) konfokal mikroskopi billede viser den cirkulære tværsnit af HUVEC'er foring kanalnet. Skalapanelerne: 100 um.
Videosekvensen 3. Konfokal film viser cellen foring langs den cirkulære kanal netværk.iles/ftp_upload/50771/50771movie3.wmv "target =" _blank "> Klik her for at se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1.. Master skimmel fabrikation
En af de designe og vejledende principper for vaskulær morfometri er kendt som Murray lov 16, hvor det hedder, at fordelingen af fartøjets diametre hele nettet reguleres af minimum energi overvejelse. Det fastslås også, at terningen af diametre på en forælder fartøj på en tvedeling er lig summen af de terninger af diametre datter fartøjer ( 
) 19 Derudover har Poiseuilles lov blevet anvendt til at estimere omfanget af den forskydningsspænding i de fleste af vaskulaturen 
. hvori1eq3.jpg "src =" / files/ftp_upload/50771/50771eq3.jpg "width =" 25px "/> er det hæmodynamiske forskydningsspænding, μ er blodets viskositet, Q er strømningshastigheden, og R er radius af det fartøj 20,21. Til symmetriske bifurkationer, en vigtig konsekvens baseret på Murray lov og Poiseuilles lov er at væggen forskydningsspænding forbliver konstant gennem vaskulære netværk. Således for en fabrikeret symmetrisk mikrofluid kanal netværk med cirkulært tværsnit, hvis kanalen dimensioner på bifurcations adlyde Murray lov bør forskydningsspænding opleves af endotelceller være konstant ved forskellige forgreninger kanaler.
Mange microfabrication teknikker og fremgangsmåder er blevet anvendt til fremstilling af mikrokanaler anvendes til vaskulære celler 22-25, men de resulterende microchannels resulterede i rektangulære, kvadratiske eller trapezformet tværsnit af kanaler. De rektangulære tværsnit af kanaler er construeret med skarpe hjørner og pludselige overgange på bifurcations, som kan pålægge meget varierende væske forskydningsspændinger og nonfysiologiske geometrier på celler i forskellige kanalpositioner, hvilket resulterer i variationer i celle fysiologi 26,27.
En fotoresist reflow proces, hvilket resulterer i en afrundet kanal profil, omfatter to procedurer, 1) smeltning af det mønstrede fotoresist og væsken modstå overflader er trukket ind i en form, som minimerer systemets energi 28,29 og 2) en køling og størkning fase følger smelteprocessen. De figurer af ombrudte kanaler er godt tilnærmes ved en halvcylindrisk overflade. Efterfulgt af ombrudt mastermodel fabrikation, blev en standard blød litografi tilgang, der anvendes til at fremstille PDMS mikrofluid kanal netværk med et cirkulært tværsnit. Vores resultater viste, at den fotoresist reflow teknik kan skabe flere dybdegående forgrening mikrokanalplader net i en mere straightt fremad tilgang, og tillader os at designe mikrovaskulære biomimetiske systemer, der omtrent adlyde Murray lov og efterligner geometrien af in vivo mikrovaskulatur, således at den samlede kanal modstanden er lav, og forskydningsspændingen variationer på forskellige forgreninger niveauer kan minimeres i den fremstillede mikrofluid kanal netværk.
De fysiologiske blod mikrokar vedtage en nogenlunde cirkulært tværsnit med radier mellem 30-300 um 30. Dimensionerne for demonstreret mikrokanalplade netværk i dette papir blev varieret omkring 60 um til 100 um på forskellige forgreninger niveauer. At fabrikere microchannels med forskellige udvalg af diametre for at efterligne in vivo mikrokar, anbefaler vi at bruge en enkelt spundet layer reflow modstå (begrænset til 30 um) eller andet lavere viskositet modstår. For en mikrokanalplade med en større diameter (30-60 um), kan en dobbelt-coating procedure for at få en tykkere fotoresistfilm15.. Yderligere spin-belægninger over to lag bør undgås for at forhindre uensartet lagtykkelse, hvilket kan resultere i en unøjagtig eksponeringsdosis. For en lagtykkelse over 60 um, er andre højere tyktflydende reflow fotoresists anbefales.
I en ideel tilstand, en at fabrikere modstå mug med et halvcirkulært tværsnit, kan filmtykkelsen indledningsvis forudbestemt ved at give en ønsket bredde og brændvidde mikrokanalplade som 
, Hvor H er den krævede spundet filmtykkelse, r er halvdelen af kanalbredden, R er konstant krumningsradius, h er den centrale højde krumning, og E er forholdet modstå mængder mikrokanalplade før og efter reflowing 31. For en cylindrisk overflade af en given bredde af mikrokanalplade, er en bestemt mængde af modstå reholdelse. Imidlertid har flere parametre blevet rapporteret at påvirke ombrudt fotoresist og gøre den resulterende kanal profilerne mere kompleks, såsom kritiske vinkel og grænsen bevægelse mellem fotoresist og det faste substrat, materiale fordampning under reflow bagning, temperatur og timing for reflow proces, afgasning, underlag ensartethed, og modstå egenskaber 32-34. For eksempel kan reflow temperatur og timing resultere i en volumenændring forårsager grænsen bevægelse og dermed variere kritiske vinkel og endelig ombrydes modstå profil 33. Som rapporteret af vores tidligere arbejde 15 til reflow processen faldt de kanalbredder med 2% i gennemsnit på grund af fotoresistbelagte volumen reduktioner og grænsen bevægelse. Desuden skal mængden for at få en cylindrisk overflade for at tage hensyn til virkningen af materialets fordampning under reflow processen 35,36. Hvis cylindriske overflader med forskellige radier er påkrævet veden mikrokanalplade netværk er det nødvendigt at variere bredden af mikrokanaler, hvilket resulterer i variationer i mængderne på forskellige regioner i netværket 15.. For med held at fabrikere en cylindrisk kanal netværk med forskellige diametre, den modstår bredder / mængder, reflow temperaturer og timing, kritiske vinkler, grænsen bevægelse, modstå viskositeter og spincoating protokoller og substrat egenskaber skal overvejes og afprøves.
2.. Langsigtet cellekultur
Betydningen af strømning og den tilhørende væg forskydningsspænding er blevet godt anerkendt i reguleringen endotel biologi. Dette er set i områder såsom inducere ændringer i celle form og orientering, sekretion og organisation, proliferation og differentiering, intracellulære signalsystemer, cytoskeleton protein produktion og genekspression, fartøj modning og struktur, og barriere funktioner 37-47. Den nuværende in vitro-metoder til dannelse endeothelial rør generelt er afhængige af endothelceller '(ECS) selvorganisering med eller uden mesenkymceller i ekstracellulære matrix (ECM) (type I kollagen, fibrin eller Matrigel) 48-54. Selv om disse kulturer med succes har modelleret flere mikrovaskulære adfærd, de kunstige skibe dannet gennem en tilfældig proces morfogenese mangler den ønskede rumlige reproducerbarhed og orientering. Derudover er virkningen af flow på mikrovaskulære stabilitet er stort set ukendt, fordi disse selvsamlede fartøjer ikke nemt kombinere luminale flow med en 3D rørformet organisation 55, udgør en udfordring for ingeniør blodkar til at have barriere funktioner og langsigtede vaskulære stabilitet.
Mikrofluide systemer har vist sig at være praktisk og nyttig til indføring strømme til en række biokemiske og biologiske analyser 56,57. Vores tilgang giver en bekvem måde at introducere væske flow over de dyrkede celler. Vi brugte enavancerede fjernstyrede sprøjtepumpe for at opnå en bekvem, men stabil og præcis flowkontrol gennem microchannels for langsigtet cellekultur (mellem 4 dage og 2 uger).
3.. Cellekultur i chippen
Plasma-assisteret oxidation af PDMS microchannels introducerer silanolgrupper (SiOH) på overfladerne, som gengiver overfladen hydrofil og aids i yderligere protein belægninger. Forskellige ECM-proteiner (fibronectin, gelatine og kollagen) blev testet for cellebinding, og det bedste resultat blev fundet at være fibronectin overtræk. De HUVEC'er blev fremstillet i en koncentration på 3 x 10 6 celler / ml i et kulturmedie suppleret med 8% dextran (70 kDa) til såning. Dextran forøger viskositeten af medierne for at aktivere finkontrol podning densitet EC'er.
En sammenflydende monolag blev udviklet mellem 2-4 dage af HUVEC'er bliver udsat for en konstant mediestrøm. At visualisere cellerne eftercellekultur, vi mærkede celler med membranfarvning og kerner farvning farvestoffer, disse farvestoffer udviste lavere cytotoksicitet 58.. Vi farves cellerne som et klæbende monolag dyrket i chippen. En komplet 1x PBS vask er nødvendig for at forhindre ekstra farvestoffer fanget inde i chippen.
Sammenfattende ved kombinationen af reflow photoresist teknik og PDMS replikation blev de udviklede multi-dybde mikrokanalplade netværk estimeres ved en cirkulær overflade og den kanal diameter i hver forgrening ca adlyde Murray lov. Forskydningsbelastningen variationer på forskellige forgrening niveauer kan minimeres i fabrikerede mikrofluid kanal netværk. Derudover indikerede resultaterne, fra cellekultur den sunde tilstand af endothelcellerne. Således udviklede endothelialized microchannels-on-a-chip giver en hurtig og reproducerbar metode til at skabe cirkulært tværsnit multi-forgrening og multidepth mikrokanalplader netværk, som efterlignergeometri af in vivo mikrokar. Proceduren illustrerer brugen af unikke kompetencer i avanceret micromanufacturing og microfluidic teknologier til at skabe en mikrovaskulaturen model med en langsigtet, kontinuerlig perfusion kontrol samt høj kvalitet og real-time scanning kapacitet. Med den stigende nytten af mikrofluidkanaler for cellebiologi, tissue engineering, og naturnær applikationer, de endothelialized microchannels-on-a-chip er en potentiel assay for microvascular forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Denne forskning blev delvist støttet af National Science Foundation (NSF 1.227.359), WVU EPSCoR program finansieret af National Science Foundation (EPS-1.003.907), WVU ADVANCE kontor sponsoreret af National Science Foundation (1.007.978) og WVU PSCoR hhv. Den microfabrication arbejde blev udført i WVU fælles forskning Faciliteter (renrumsfaciliteter) samt Mikrofluid Integrativ Cellular Forskning i Chip Laboratory (mikrochip Lab) ved West Virginia University. Den konfokal imaging blev udført på WVU Microscope Imaging faciliteten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Reflow Photoresist | AZ Electronic Materials | AZP4620 | |
| Developer | AZ Electronic Materials | AZ 400K | |
| PDMS | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| MCDB 131 Culture Medium | Invitrogen | 10372-019 | |
| NacBlue Nuclei Staining | Invitrogen | H1399 | |
| PKH Red Stain | Sigma | MINI26 and PKH26GL | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| Phosphate Buffered Saline | Invitrogen | 14040-133 | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Trypsin/EDTA | Invitrogen | 25300-062 | |
| Trypsin Neutralizing Solution | Lonza | CC-5002 | |
| PDMS Curing Agent | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells | Lonza | CC-2517 | |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-501F | |
| Diluent C | Sigma | CGLDIL | |
| Hoechst33342 | Invitrogen, Molecular Probes | R37605 | |
| Dextran | Sigma | 95771 | |
| 3.5% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Science | 15710-S | |
| Equipment | |||
| Spinner | Laurell Technologies Corporation | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
| Desiccator | BelArt Products | 999320237 | |
| Inverted Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Syringe Pump System | Harvard Apparatus | PHD Ultra | |
| Laminar Biosafety Hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Planetary Centrifugal Mixer | Thinky | ARE-310 | |
| Isotemp Oven | Fisher Scientific | 13-246-516GAQ | |
| Optical Microscope | Zeiss | Invertoskop 40C | |
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Hotplate | Barnstead/Thermolyne Cimarec | SP131635 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 |
References
- Adair, T. H. Angiogenesis: Integrated systems physiology: from molecule to function to disease. , 1st edition, Biota Publishing. (2011).
- Goodwin, A. M. In vitro assays of angiogenesis for assessment of angiogenic and anti-angiogenic agents. Microvasc. Res. 74, 172-183 (2007).
- Smith, E. J., Staton, C. A. Tubule formation assays. Angiogenesis assays: A critical appraisal of current techniques. , John Wiley & Sons Ltd. West Sussex, UK. 65-87 (2006).
- Nakatsu, M. N., Davis, J. J., Hughes, C. C. W. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. J. Vis. Exp. (3), e186 (2007).
- Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Lab. Invest. 63, 115-122 (1990).
- Aplin, A. C., Fogel, E., Zorzi, P., Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 119-136 (2008).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: A quarter century of search and discovery. J. Cell. Mol. Med. 13, 4113-4136 (2009).
- Griffith, L. G., Swart, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 211-224 (2006).
- Folkman, J. History of angiogenesis. Angiogenesis: An integrative approach from science to medicine. , Springer. (2008).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: A critical overview. Clin. Chem. 49, 32-40 (2003).
- Auerbach, R., Akhtar, N., Lewis, R. L., Shinners, B. L. Angiogenesis assays: Problems and pitfalls. Cancer Metastasis Rev. 19, 167-172 (2000).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
- Staton, C. A., Stribbling, S. M., et al. Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int. J. Exp. Pathol. 85, 233-248 (2004).
- Moraes, C., Mehta, G., Lesher-Perez, S. C., Takayama, S. Organs-on-a-Chip: A focus on compartmentalized microdevices. Ann. Biomed. Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
- Huang, Z., Li, X., Martins-Green, M., Liu, Y. Microfabrication cylindrical microfluidic channel networks for microvascular research. Biomedical Microdevices. 14 (5), 873-883 (2012).
- Murray, C. D. The physiological principle of minimum work applied to the angle of branching of arteries. J. Gen. Physiol. 9 (6), 835-841 (1926).
- Zamir, M., Medeiros, J. A. Arterial branching in man and monkey. J. Gen. Physiol. 79, 353-360 (1982).
- Gafiychuk, V. V., Lubashevsky, I. A. On the principles of the vascular network branching. J. Theor. Biol. 212, 1-9 (2001).
- Sherman, T. F. On connecting large vessels to small. The meaning of Murray's law. J. Gen. Physiol. 78 (4), 431-453 (1981).
- Kamiya, A., Bukhari, R., Togawa, T. Adaptive regulation of wall shear stress optimizing vascular tree function. Bull Math Biol. 46 (1), 127-137 (1984).
- LaBarbera, M. Principles of design of fluid transport systems in zoology. Science. 249, 992-1000 (1990).
- Emerson, D. R., Cieslicki, K., Gu, X., Barber, R. W. Biomimetic design of microfluidic manifolds based on a generalized Murray's law. Lab Chip. 6, 447-454 (2006).
- Lu, H., Koo, L. Y., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal. Chem. 76, 5257-5264 (2004).
- Shevkoplyas, S. S., Gifford, S. C., Yoshida, T., Bitensky, M. W. Prototype of an in vitro model of the microcirculation. Microvasc. Res. 65, 132-136 (2003).
- Kaihara, S., Borenstein, J., et al. Silicon micromachining to tissue engineer branched vascular channels for liver fabrication. Tissue Eng. 6, 105-117 (2000).
- Fisher, A. B., Chien, S., Barakat, A. I., Nerem, R. M. Endothelial cellular response to altered shear stress. Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 281 (3), L529-L533 (2001).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1 (8), 759-766 (1990).
- Schilling, A., Merz, R., Ossmann, C., Herzig, H. P. Surface profiles of reflow microlenses under the influence of surface tension and gravity. Opt. Eng. 39 (8), 2171-2176 (2000).
- Young, B., Heath, J. W. Wheater's functional histology: A text and colour atlas. , 4th edition, Churchill Livingstone. (2000).
- O'Neill, F. T., Sheridan, J. T. Photoresist reflow method of microlens production. Part 1: Background and experiments. Optik Int. J. Light Electron Opt. 113, 391-404 (2002).
- de Gennes, P. G.
- Elias, H. G. An Introduction to Polymer Science. , VCH Publishers. New York. (1997).
- Voinov, O. V. Dynamic edge angles of wetting upon spreading of a drop over a solid surface. J. Appl. Mech. Tech. Phys. 40, 86-92 (1999).
- Daly, D., Stevens, R. F., Hutley, M. C., Davies, N. The manufacture of microlenses by melting photoresist. Meas. Sci. Technol. 1, 759 (1990).
- Jay, T. R., Stern, M. B. Preshaping photoresist for refractive microlens fabrication. Opt. Eng. 33, 3552-3555 (1994).
- Nerem, R. M., Alexander, R. W., et al. The Study of the influence of flow on vascular endothelial biology. Am. J. Med. Sci. 316 (3), 169-175 (1998).
- Chien, S., Li, S., Shyy, Y. J. Effects of mechanical forces on signal transduction and gene expression in endothelial cells. Hypertension. 31, 162-169 (1998).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Lee, E. J., Vunjak-Novakovic, G., Wang, Y., Niklason, L. E. A biocompatible endothelial cell delivery system for in vitro tissue engineering. Cell Transplant. 18, 731-743 (2009).
- Lee, E. J., Niklason, L. E. A novel flow bioreactor for in vitro microvascularization. Tissue Eng. Part C Methods. 16, 1191-1200 (2010).
- Chau, L., Doran, M., Cooper-White, J. A novel multishear microdevice for studying cell mechanics. Lab Chip. 9, 1897-1902 (2009).
- Meeson, A., Palmer, M., Calfon, M., Lang, R. A relationship between apoptosis and flow during programmed capillary regression is revealed by vital analysis. Development. 122, 3929-3938 (1996).
- Van Royen, N. J., Piek, J., Schaper, W., Bode, C., Buschmann, I. Arteriogenesis: mechanisms and modulation of collateral artery development. J. Nucl. Cardiol. 8, 687-693 (2001).
- Schaper, W.
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovas. Res. 87 (2), 320-330 (2010).
- Potter, C. M., Lundberg, M. H., et al. Role of shear stress in endothelial cell morphology and expression of cyclooxygenase isoforms. Arterioscler. Thromb. Vasc Biol. 31, 384-391 (2011).
- Montesano, R. In vitro rapid organization of endothelial cells into capillary-like networks is promoted by collagen matrices. J. Cell Biol. 97, 1648-1652 (1983).
- Darland, D. C., D'Amore, P. A. TGF beta is required for the formation of capillary-like structures in three-dimensional cocultures of 10T1/2 and endothelial cells. Angiogenesis. 4 (1), 11-20 (2001).
- Lawley, T. J., Kubota, Y. Induction to morphologic differentiation of endothelial cells in culture. J. Invest. Dermatol. 93, 59S-61S (1989).
- Kanzawa, S., Endo, H., Shioya, N. Improved in vitro angiogenesis model by collagen density reduction and the use of type III collagen. Ann. Plast. Surg. 30, 244-251 (1993).
- Davis, G. E., Bayless, K. J., Mavila, A. Molecular basis of endothelial cell morphogenesis in three-dimensional extracellular matrices. Anat. Rec. 268, 252-275 (2002).
- Velazquez, O. C., Snyder, R., Liu, Z., Fairman, R. M., Herlyn, M. Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular endothelial cells into capillary-like 3-dimensional networks. FASEB J. 16, 1316-1318 (2002).
- Donovan, D., Brown, N. J., Bishop, E. T. Comparison of three in vitro human "angiogenesis" assays with capillaries formed in vivo. Angiogenesis. 4, 113-121 (2001).
- Tang, D. G., Conti, C. J. Endothelial cell development, vasculogenesis, angiogenesis, and tumor neovascularization: an update. Semin. Thromb. Hemost. 30, 109-117 (2004).
- Takayama, S., McDonald, J. C., et al. Patterning cells and their environments using multiple laminar fluid flows in capillary networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5545-5548 (1999).
- Cho, B. S., Schuster, T. G., et al. Passively driven integrated microfluidic system for separation of motile sperm. Anal. Chem. 75, 1671-1675 (2003).
- Parsa, H., Upadhyay, R., Sia, S. K. Uncovering the behaviors of individual cells within a multicellular microvascular community. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (12), 5133-5138 (2011).
