एक सीरम मुक्त पूरे भ्रूण संस्कृति प्रणाली में माउस भ्रूण विकास
Summary
भ्रूण संस्कृतियों में उपयोग सीरम विशेष रूप से संकेत बातचीत शामिल अध्ययन में प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं कि अज्ञात घटक शामिल हैं. यहाँ हम एक सीरम मुक्त ऑक्सीजन संस्कृति प्रणाली का उपयोग किया और 16-40 घंटे के लिए सुसंस्कृत मध्य हमल माउस भ्रूण गर्भ में भ्रूण के विकास के लिए तुलनीय रूपात्मक विकास दिखा रहे हैं दिखा.
Abstract
मध्य हमल चरण माउस भ्रूण एक oxygenated रोलिंग बोतल संस्कृति प्रणाली में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्टेम सेल मीडिया की खुराक से तैयार एक सीरम मुक्त मध्यम संस्कृति के उपयोग सुसंस्कृत थे. E10.5 पर माउस भ्रूण ध्यान से बरकरार जर्दी थैली के साथ गर्भाशय से अलग थे और जर्दी थैली के साथ भ्रूण की नाड़ी निरंतरता बनाए रखते हुए सटीक शल्य पैंतरेबाज़ी शामिल प्रक्रिया में भ्रूण धीरे जर्दी थैली से exteriorized गया. बरकरार जर्दी थैली के साथ या हटाया जर्दी थैली के साथ तैयार भ्रूण की तुलना में, इन भ्रूण बेहतर जीवित रहने की दर और इसी तरह की परिस्थितियों में सुसंस्कृत जब विकास की प्रगति का प्रदर्शन किया. हम इन माउस भ्रूण, जब 16-40 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% हे एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में 2/5% सीओ 2 के माहौल में एक परिभाषित मध्यम में संवर्धित करने के लिए तुलनीय रूपात्मक वृद्धि और विकास का प्रदर्शन चलता है कि भ्रूण गर्भ में विकसित करने. हम वें विश्वासविधि भ्रूण जीवोत्पत्ति में महत्वपूर्ण संकेत बातचीत का अध्ययन करने के लिए पूरे भ्रूण संस्कृति का उपयोग करने की आवश्यकता होगी, जांचकर्ताओं के लिए उपयोगी हो जाएगा है.
Introduction
इन विट्रो में पूरे भ्रूण का उपयोग संस्कृति तरीकों utero में उपयोग करने के लिए नहीं तो मुश्किल हो जाता है कि भ्रूण जीवोत्पत्ति में शामिल तंत्र संकेत अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं. पूरे भ्रूण ऊतक अखंडता प्रदान करने और आवश्यक तंत्र संकेत के समय पर घटना के लिए महत्वपूर्ण हैं कि ऊतक बातचीत के लिए उचित समर्थन जीवोत्पत्ति के दौरान अलग सेलुलर प्रक्रियाओं के लिए. पूरे भ्रूण संस्कृतियों आदि प्रत्यारोपण के अध्ययन, आनुवंशिक और ऊतक जोड़तोड़, मनका आरोपण पढ़ाई, विषाक्तता अध्ययन, के रूप में आवेदन के ढेर के लिए एक मंच प्रदान करता है., वर्तमान में उपयोग भ्रूण संस्कृति प्रणालियों भ्रूण के समुचित विकास और रखरखाव के लिए सीरम पर मुख्य रूप से निर्भर हैं संस्कृति 1-9 में.
सीरम संस्कृति मीडिया में 6-8, 10, 11 के 10-100% से लेकर प्रमुख घटकों में से एक के रूप में उपयोग किया गया है.हालांकि, सीरम की रचना अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है और पशुओं को पशु से अलग कर सकते हैं और हर बार सीरम एकत्र किया जाता है. सीरम की प्रयोगशाला तैयारी समय लगता है और कड़े प्रक्रियाओं शामिल है, की खरीद सीरम व्यावसायिक रूप से अलग बहुत सारे के बीच काफी परिवर्तनशीलता दर्शाती है और प्रयोगात्मक लागत को जन्म देती है. इन करने के लिए जोड़ा गया, सीरम इस तरह के संभावित कुछ प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं जो वृद्धि कारकों, हार्मोन, या अन्य प्रोटीन, ऊतक बातचीत में महत्वपूर्ण संकेतन अणुओं का अध्ययन शामिल है कि विशेष रूप से उन लोगों के रूप में अज्ञात कारणों हो सकते हैं. अध्ययन संस्कृति के लिए सीरम के अलावा संभवतः ऐसे चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) और mitogenic संकेतन और phosphoinositide 3 में शामिल प्रोटीन (पीआई) 3-kinase रास्ते 12-14 संकेत के रूप में कुछ संकेतन अणुओं के intracellular स्तर को बदल सकते हैं कि पता चला है. इन के विपरीत, एक सीरम मुक्त संस्कृति प्रणाली, प्रतिजन मुक्त वातावरण का लाभ प्रदान करता हैसेलुलर प्रक्रियाओं को बदलने और कर सकते हैं कि जैविक रूप से सक्रिय एंजाइमों से संयम प्रयोगों के बीच स्थिरता सक्षम बनाता है.
अध्ययन में मौजूद है, हम 37 में 95% ओ एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में 2/5% सीओ 2 के माहौल में संस्कृति के मध्य हमल चरण पूरे भ्रूण को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्टेम सेल मीडिया की खुराक से तैयार एक सीरम मुक्त संस्कृति के माध्यम से उपयोग सी 15,16 °. इन परिभाषित परिस्थितियों में 16-40 घंटे के लिए सभ्य माउस भ्रूण सेलुलर प्रसार, प्रवास, भेदभाव और ऊतक बातचीत के उचित स्तर का संकेत ऐसे दिल, अंग, मस्तिष्क और आंखों के रूप में समग्र भ्रूण शरीर और विभिन्न योजनाओं के रूपात्मक विकास में प्रगति का प्रदर्शन किया. ऐसी आंख के रूप में जटिल अंग प्रणालियों में से एक के लिए संस्कृति में भ्रूण के विकास के आण्विक विश्लेषण embr में नेत्र ऊतक में मनाया उस के साथ लगातार हो आंख का विकास का पता चलाYos (तैयारी में, Kalaskar और लॉडरडेल) utero में विकास. इस प्रकार हम मध्य हमल चरण में सभ्य माउस भ्रूण गर्भ में भ्रूण के विकास में मनाया बराबर प्रगतिशील विकास और रूपात्मक विकास दिखा रहे हैं दिखा.
Protocol
Representative Results
Discussion
मध्य हमल चरण माउस भ्रूण 37 डिग्री सेल्सियस पर 95% 2 हे / 5 एक रोलिंग बोतल संस्कृति तंत्र में% सीओ 2 के माहौल में एक सीरम मुक्त संस्कृति मीडिया में सुसंस्कृत थे भ्रूण के विकास के लिए पूर्व utero गर्भाशय …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम संस्कृति तकनीक के साथ अपने उपयोगी सलाह के लिए डॉ. जूली गॉर्डन और डॉ. नैन्सी Manley धन्यवाद देना चाहूंगा. यह काम बच्चों के रोग फाउंडेशन और शेरोन-स्टीवर्ट अपरितारकता रिसर्च ट्रस्ट द्वारा समर्थन किया गया है.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
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