Rato Desenvolvimento Embrionário em todo um sistema de cultura de embriões sem soro
Summary
Soro utilizado em culturas de embriões contém componentes desconhecidos que podem afetar o resultado de experimentos especialmente em estudos que envolvem interações de sinalização. Aqui, utilizamos um sistema de cultura oxigenado sem soro e mostram que os embriões no meio da gestação rato cultivadas durante 16-40 horas apresentam desenvolvimento morfológico comparável aos embriões em desenvolvimento in utero.
Abstract
Embriões fase mid-gestação de rato foram cultivadas utilizando um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis em um sistema de cultura em frasco de rolamento oxigenado. Mouse embriões em E10.5 foram cuidadosamente isolada do saco vitelino com útero intacto e num processo que envolve a manobra cirúrgica precisa os embriões foram gentilmente exteriorizado partir do saco vitelino, enquanto mantém a continuidade vascular do embrião com o saco vitelino. Em comparação com os embriões preparados com saco vitelino intacta ou com o saco vitelino removidos, estes embriões apresentaram a taxa de sobrevivência superior e progressão do desenvolvimento, quando cultivadas sob condições semelhantes. Mostramos que estes embriões de ratinho, quando cultivadas num meio definido em uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C durante 16-40 horas, exibem crescimento e desenvolvimento morfológico comparável à os embriões em desenvolvimento no útero. Acreditamos ªé o método será útil para pesquisadores que necessitam de utilizar a cultura do embrião inteiro para estudar interações de sinalização importantes na organogênese embrionária.
Introduction
In vitro, utilizando métodos de cultura de embriões inteiros são adequados para estudar mecanismos de sinalização envolvidos na organogênese embrionária que são de outra maneira difícil acesso no útero. Embriões inteiros fornecer a integridade dos tecidos e apoio adequado para as interações de tecido que são cruciais para a ocorrência oportuna de mecanismos de sinalização essenciais para diferentes processos celulares, durante a organogénese. Enquanto as culturas de embriões inteiros fornecer uma plataforma para uma infinidade de aplicações, tais como estudos de transplante, manipulações genéticas e de tecidos, estudos de implantação do grânulo, estudos toxicológicos, etc., Sistemas de cultura de embriões atualmente utilizados são principalmente dependentes de soro para o crescimento e manutenção dos embriões na cultura 1-9.
O soro foi utilizado como um dos principais componentes que variam entre 10-100% do meio de cultura de 6-8, 10, 11.; No entanto, a composição do soro não está bem definida e pode variar de animal para animal e cada vez que o soro é recolhido. Enquanto preparação laboratorial de soro é demorado e envolve procedimentos rigorosos, o soro obtido exibe comercialmente considerável variabilidade entre lotes diferentes e aumenta os custos experimentais. A estes, o soro pode conter factores desconhecidos, como factores de crescimento, hormonas, ou outras proteínas, o que pode, potencialmente, afectar o resultado de certas experiências, especialmente aqueles que envolvem o estudo de moléculas de sinalização importantes em interacções de tecidos. Estudos têm mostrado que a adição de soro para a cultura pode potencialmente alterar os níveis intracelulares de determinadas moléculas de sinalização, tais como o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) e de proteínas envolvidas na sinalização mitogénica e fosfoinositida 3 (PI3), as vias de sinalização da cinase 12-14. Contrariamente a isso, um sistema de cultura isento de soro, proporciona as vantagens de ambiente antigénio livre,abstinência de enzimas biologicamente ativas que podem alterar os processos celulares e permite a consistência entre experimentos.
No presente estudo, utilizámos um meio de cultura isento de soro preparado a partir de células-tronco suplementos media comercialmente disponíveis para a cultura da fase mid-gestação de embriões inteiros de uma atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C 15,16. Mouse embriões cultivados em 16 a 40 horas sob estas condições definidas apresentaram progressão para o desenvolvimento morfológico de corpo e diferentes estruturas embrionárias gerais, tais como o coração, membros, cérebro e olhos, indicando níveis adequados de proliferação celular, a migração, a diferenciação e as interacções de tecidos. A análise molecular do desenvolvimento embrionário em cultura por um dos sistemas de órgãos complexos como o olho revelou o desenvolvimento ocular para ser coerente com o observado no tecido ocular em embryos desenvolvendo no útero (Kalaskar e Lauderdale, em preparação). Assim, mostramos que os embriões de rato cultivadas em fase mid-gestação, apresentam um crescimento progressivo e desenvolvimento morfológico comparável à observada nos embriões em desenvolvimento in utero.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embriões fase mid-gestação de ratinho foram cultivadas num meio de cultura livre de soro, numa atmosfera de 95% O2 / 5% de CO 2, num aparelho de cultura de garrafa de rolamento a 37 ° C. O desenvolvimento embrionário ex útero foi criticamente dependente de vários factores, em cada passo durante o processo a partir do momento que o útero é isolado a partir de murganhos sacrificados para a realização da cultura (Figura 1). O fator mais importante que influenciou o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Dr. Julie Gordon e Dr. Nancy Manley para o seu conselho útil com a técnica de cultura. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Glaucoma Infantil e Sharon-Stewart Aniridia Research Trust.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
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