無血清全胚培養系で、マウス胚発生
Summary
胚培養に利用される血清は、特にシグナル伝達の相互作用を含む研究での実験の結果に影響を与えることができ、未知のコンポーネントが含まれています。ここでは、無血清酸素化培養系を利用し、16〜40時間培養妊娠中期のマウス胚が子宮内で発生中の胚に匹敵する形態的発展を示すことを示している。
Abstract
妊娠中期段階のマウス胚の酸素圧延ボトル培養系で商業的に入手可能な幹細胞培地補充物から調製された無血清培地を用いて培養した。 E10.5でのマウス胚を慎重に無傷の卵黄嚢と子宮から単離し、卵黄嚢と胎児の血管の連続性を維持しながら、正確な外科的手技を含むプロセスにおいて胚をゆっくりと卵黄嚢から体外た。無傷の卵黄嚢または削除卵黄嚢を用いて調製した胚と比較して、これらの胚は、優れた生存率と同様の条件下で培養し、発生の進行を示した。我々は、これらのマウス胚は、ときに16〜40時間、37℃で95％O圧延ボトル培養装置での2/5％CO 2の雰囲気中で定義された培地で培養し、匹敵する形態学的成長と発展を示すことを示して胚は子宮内での開発。我々は目を信じるこの方法は、胚器官形成において重要なシグナル伝達相互作用を研究するために全胚培養を利用する必要が捜査のために有用である。
Introduction
全体の胚を用いた体外培養法では子宮内でアクセスしにくい胚の器官形成に関与するメカニズムのシグナリングの研究に非常に適しています。全胚組織の完全性を提供し、必要不可欠なシグナル伝達機構の適時発生に重要である組織の相互作用のための適切なサポート器官形成中に異なる細胞プロセスのため。全胚培養物は、移植研究、遺伝的および組織操作、ビード移植研究、毒物学的研究等のような用途の過多のためのプラットフォームを提供しているが、現在利用胚培養システムは、胚の適切な成長および維持のために血清に主に依存している文化1-9。
血清は、培養培地6-8、10、11 10〜100％の範囲の主要成分の一つとして利用されている。;しかし、血清の組成物は、明確なものではなく、動物に、動物異なり、血清が収集されるたびにすることができる。血清の実験室の準備は時間がかかり、厳しい手順が含まれますが、血清調達は、商業的に異なるロット間でかなりのばらつきを示し、実験的なコストを発生させます。これらに加え、血清は、潜在的に特定の実験の結果に影響を与えることができ、このような成長因子、ホルモン、または他のタンパク質などの未知の要因、組織の相互作用において重要なシグナル伝達分子の研究を含むことを特に含むことができる。研究は、培養物への血清の添加は潜在的にそのようなサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）および分裂促進シグナル伝達およびホスホイノシチド3に関与するタンパク質（PI 3） -キナーゼ経路の12-14シグナルのような特定のシグナル伝達分子の細胞内レベルを変化させることができることを示している。これらとは逆に、無血清培養系は、抗原を含まない環境の利点を提供する細胞プロセスを変化させ、実験間の一貫性を可能にすることができ、生物学的に活性な酵素から禁欲。
本研究では、37℃で圧延ボトル培養装置で95％O 2/5％CO 2の雰囲気中で培養妊娠中期段階の胚全体に市販されている幹細胞培地補充物から調製された無血清培地を利用したC 15,16°。これらの定義された条件の下で16から40時間培養したマウス胚は、細胞の増殖、遊走、分化および組織の相互作用の適切なレベルを示す全体的な胚の体と、心臓、手足、脳や目などの異なる構造の形態的発展の進行を示した。眼などの複雑な器官系の1のため、培養中の胚発生の分子解析はEMBRで眼組織で観察されたものと一致するように、眼の開発を明らかにした（準備中、Kalaskarとローダーデール）の子宮内での開発ヨーヨー。したがって、私たちは、妊娠中期段階で培養したマウス胚は、 子宮内で発生中の胚で観察されたものに匹敵する進歩的な成長と形態的発展を示すことを示している。
Protocol
Representative Results
Discussion
妊娠中期段階のマウス胚は、37℃でのローリングボトル培養装置で95％O 2/5％CO 2の雰囲気下で無血清培地中で培養した。胚発生の元の子宮は、子宮は培養終了します（ 図1）に安楽死させたマウスから単離した時点から手術中の各段階で複数の要因に決定的に依存していた。現像に影響を与えた最も重要な要因は、培養を開始するのに要する時間であった。最も注意…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、培養技術との有益な助言のために博士ジュリー·ゴードン博士ナンシーマンリーに感謝したいと思います。この作品は子供の緑内障財団とシャロン·スチュワート無虹彩症研究の信頼によってサポートされています。
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
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