Mouse embryonala utveckling i ett serumfritt Hela Embryo Culture System
Summary
Serum används i embryokulturer innehåller okända komponenter som kan påverka utfallet av experiment, särskilt i studier med signal interaktioner. Här har vi använt en serumfri oxygenerad odlingssystemet och visar att i mitten av dräktigheten musembryon odlade under 16-40 tim uppvisar morfologisk utveckling som är jämförbar med embryon som utvecklas i livmodern.
Abstract
Embryon mitt i dräktigheten skede mus odlades använda ett serumfritt odlingsmedium framställs från kommersiellt tillgängliga stamcellsmedia tillskott i en syresatt rullande flaska odlingssystem. Mus embryon vid E10.5 noggrant isolerad från livmodern med intakt gulesäcken och i en process med noggrann kirurgisk manöver embryona försiktigt exteriorized från gulesäcken medan kärl kontinuitet embryot upprätthålla med gulesäcken. Jämfört med embryon framställda med intakt gulesäcken eller med gulesäcken avlägsnas, dessa embryon uppvisade överlägsen överlevnadsgrad och utvecklande progression vid odling under liknande förhållanden. Vi visar att dessa musembryon, när de odlas i ett definierat medium i en atmosfär av 95% O2 / 5% CO2 i en rullande flaskodling-apparat vid 37 ° C under 16 till 40 timmar, uppvisar morfologisk tillväxt och utveckling som är jämförbar med embryona utvecklas i livmodern. Vi tror thär metoden kommer att vara användbart för utredarna att behöva utnyttja hela embryo kultur att studera signalering interaktioner viktiga i embryonala organogenesen.
Introduction
In vitro odlingsmetoder som utnyttjar hela embryon är väl lämpade för att studera signalering mekanismer som är involverade i foster organogenesen som annars är svåra att nå i livmodern. Hela embryon ger vävnadsintegritet och stödja lämplig för vävnadsinteraktioner som är avgörande för snabb förekomst av signalmekanismer väsentliga för olika cellulära processer under organogenesen. Medan hela embryokulturer ger en plattform för en mängd applikationer såsom transplantationsstudier, genetiska och vävnads manipulationer, pärla implantation studier, toxikologiska studier, osv., För närvarande utnyttjas embryokultursystem är främst beroende av serum för god tillväxt och underhåll av embryon i kulturen 1-9.
Serum har använts som en av de viktigaste komponenterna i intervallet 10-100% av odlingsmedierna 6-8, 10, 11.; Emellertid sammansättningen av serum är inte väl definierad och kan skilja sig från djur till djur och varje gång serumet uppsamlas. Även laboratorie beredning av serum är tidskrävande och innebär stränga rutiner, serum upphandlas uppvisar kommersiellt betydande variation mellan olika partier och höjer experimentella kostnader. Till detta kan serumet innehålla okända faktorer såsom tillväxtfaktorer, hormoner eller andra proteiner, vilket potentiellt kan påverka resultatet av vissa experiment, speciellt de som involverar studier av signalmolekyler viktiga i vävnadsinteraktioner. Studier har visat att tillsats av serum till kultur potentiellt kan förändra de intracellulära nivåerna av vissa signalmolekyler, såsom cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) och proteiner som är involverade i mitogen signalering och fosfoinositid 3 (PI-3)-kinassignalvägar 12-14. I motsats till dessa, tillhandahåller ett serumfritt odlingssystemet fördelarna med antigen fri miljö,avhållsamhet från biologiskt aktiva enzymer som kan förändra de cellulära processer och möjliggör överensstämmelse mellan experiment.
I den aktuella studien, utnyttjade vi ett serumfritt odlingsmedium framställs från kommersiellt tillgängliga stamcellsmedia tillskott till kultur mitt i dräktigheten scen hela embryon i en atmosfär av 95% O 2/5% CO 2 i en rullflaskkultur apparat vid 37 ° C 15,16. Musembryon odlade för 16 till 40 timmar under dessa definierade betingelser uppvisade progression i morfologisk utveckling av övergripande embryonala organ och olika strukturer som hjärta, armar och ben, hjärna och ögon som anger lämpliga nivåer av cellulär proliferation, migration, differentiering och vävnadsinteraktioner. Molekylär analys av den embryonala utvecklingen i kulturen för en av de komplexa organsystem såsom ögat avslöjade okulär utveckling att vara konsekvent med den som observerades i ögonvävnad i embryos utvecklas i livmodern (Kalaskar och Lauderdale, under utarbetande). Därmed visar vi att musembryon odlades vid mitten av dräktighetsstadiet, uppvisar progressiv tillväxt och morfologisk utveckling jämförbar med den som observerades hos embryon som utvecklas i livmodern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embryon Mid-gestation skede mus odlades i ett serumfritt odlingsmedium i en atmosfär av 95% O2 / 5% CO2 i en rullande flaskodling-apparat vid 37 ° C. Embryoutveckling ex utero var kritiskt beroende av flera faktorer vid varje steg under förfarandet från det att livmodern är isolerad från de avlivade möss till slutförandet av kulturen (Figur 1). Den viktigaste faktorn som påverkade utvecklingen var den tid det tog för att starta kulturen. Den andra kritiska punkte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Julie Gordon och Dr Nancy Manley för deras råd med kulturteknik. Detta arbete har stötts av Barnens Glaukom Foundation och Sharon-Stewart aniridi Research Trust.
Materials
| KnockOut DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| N-2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock: 100x |
| Albumin, from Bovine Serum | Sigma | A9418-50G | Stock: 100% |
| Antibiotic – Antimycotic Solution | Cellgro | 30-004-Cl | Stock: Penicillin (10000 IU/ml); Streptomycin (10000 µg/ml; Amphotericin (250µg/ml) |
| DMEM | Cellgro | 15-013-CV | |
| Precision Incubator Unit | B.T.C. Engineering Milton Cambridge England | Id.No. 840-374 | |
| Glass Bottles for Rotating Unit | B.T.C. Engineering | ||
| Silicone Rubber Cork | B.T.C. Engineering | ||
| 95% O2/5% CO2 Cylinder | AirGas Inc. | ||
| Stemi SV11 Apo Dissecting Microscope | Zeiss | ||
| Stemi SV6 Microscope | Zeiss | ||
| CO2 Water Jacketed Incubator | Forma Scientific | Model: 3110 | |
| Culture Hood | Nuaire Biological Safety Cabinets Class II TypeA2 | Model: Nu-425-600 | |
| Water Bath | Fisher Scientific | IsoTemp205 | |
| Weigh Balance | Mettler Toledo | AG285 | |
| Centrifuge Tube – 50ml | Corning | 430291 | |
| Light Operating Scissors | Roboz | RS-6702 | |
| Operating Sharp-Blunt Scissors | Roboz | RS-6812 | |
| Micro Dissecting Forceps – 4” | Roboz | RS-5211 | |
| Micro Dissecting Forceps – Hudson (cWALD) – 4-3/4” | Roboz | RS-5237 | |
| Micro Dissecting Tweezers (5/45) | Roboz | RS-5005 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (5) | Roboz | RS-5060 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Micro Dissecting Tweezers (55) | Roboz | RS-5063 | Modified – Sharp ends were made blunt |
| Instrument Tray | Roboz | RT-1401S | |
| Instrument Tray Lid | Roboz | RT-1401L | |
| Petri Dish-100mm | Fisher Scientific | 087571Z | |
| Petri Dish-60mm | Fisher Scientific | 0875713A | |
| Petri Dish-35mm | Fisher Scientific | 0875711YZ | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-150ml | Corning | 431153 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-250ml | Corning | 430756 | |
| Filter System ( 0.22um Cellulose Acetate)-500ml | Corning | 430758 | |
| Pipet-aid Pipetter | Drummond Scientific Co. | D57849 | |
| Serological Pipette-10ml | VWR | 89130-898 | |
| Disposable Serological Pipette-25ml | Corning | 4251 | |
| Transfer Pipette – 7.7ml | Thermo Scientific | 202-20S |
References
- Behesti, H., Holt, J. K., Sowden, J. C. The level of BMP4 signaling is critical for the regulation of distinct T-box gene expression domains and growth along the dorso-ventral axis of the optic cup. BMC Dev. Biol. 6, 62 (2006).
- Gray, J., Ross, M. E. Neural tube closure in mouse whole embryo culture. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tam, P. P. Postimplantation mouse development: whole embryo culture and micro-manipulation. Int. J. Dev. Biol. 42, 895-902 (1998).
- Miura, S., Mishina, Y. Whole-embryo culture of E5.5 mouse embryos: development to the gastrulation stage. Genesis. 37, 38-43 (2003).
- Osumi, N., Inoue, T. Gene transfer into cultured mammalian embryos by electroporation. Methods. 24, 35-42 (2001).
- Yokoo, T., et al. Human mesenchymal stem cells in rodent whole-embryo culture are reprogrammed to contribute to kidney tissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 3296-3300 (2005).
- Sadler, T. W. Culture of early somite mouse embryos during organogenesis. J. Embryol. Exp. Morphol. 49, 17-25 (1979).
- Kitchin, K. T., Ebron, M. T. Further development of rodent whole embryo culture: solvent toxicity and water insoluble compound delivery system. Toxicology. 30, 45-57 (1984).
- Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation. Dev. Growth Different. 50, 485-497 (2008).
- Cuthbertson, R. A., Beck, F. Postimplantation whole embryo culture: a new method for studying ocular development. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 31, 1653-1656 (1990).
- New, D. A. Development of explanted rat embryos in circulating medium. J. Embryol. Exp. Morphol. 17, 513-525 (1967).
- Chung, K. C., Park, J. H., Kim, C. H., Ahn, Y. S. Tumor necrosis factor-alpha and phorbol 12-myristate 13-acetate differentially modulate cytotoxic effect of nitric oxide generated by serum deprivation in neuronal PC12 cells. J. Neurochem. 72, 1482-1488 (1999).
- Sasaoka, T., et al. Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J. Biol. Chem. 269, 13689-13694 (1994).
- Chotani, M. A., Mitra, S., Eid, A. H., Han, S. A., Flavahan, N. A. Distinct cAMP signaling pathways differentially regulate alpha2C-adrenoceptor expression: role in serum induction in human arteriolar smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, 69-76 (2005).
- Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos. Genesis. 35, 164-168 (2003).
- Gordon, J., Moore, B. A., Blackburn, C. C., Manley, N. R. Serum-Free Culture of Mid-gestation Mouse Embryos: A Tool for the Study of Endoderm-Derived Organs. Methods Mol. Biol. 1092, 183-194 (2014).
- New, D. A., Cockroft, D. L. A rotating bottle culture method with continuous replacement of the gas phase. Experientia. 35, 138-140 (1979).
- Cockroft, D. L. Development in culture of rat foetuses explanted at 12.5 and 13.5 days of gestation. J. Embryol. Exp. Morphol. 29, 473-483 (1973).
- Zeeb, M., et al. Pharmacological manipulation of blood and lymphatic vascularization in ex vivo-cultured mouse embryos. Nat. Protoc. 7, 1970-1982 (2012).
- Wawersik, S., et al. BMP7 acts in murine lens placode development. Dev. Biol. 207, 176-188 (1999).
- Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens. Dev. Biol. 231, 63-76 (2001).
- Greenfield, J. P., et al. Estrogen lowers Alzheimer beta-amyloid generation by stimulating trans-Golgi network vesicle biogenesis. J. Biol. Chem. 277, 12128-12136 (2002).
- Cheng, J., Dutra, A., Takesono, A., Garrett-Beal, L., Schwartzberg, P. L. Improved generation of C57BL/6J mouse embryonic stem cells in a defined serum-free media. Genesis. 39, 100-104 (2004).
- Kim, J. B., et al. Direct reprogramming of human neural stem cells by OCT4. Nature. 461, 649-643 (2009).
- Totonchi, M., et al. Feeder- and serum-free establishment and expansion of human induced pluripotent stem cells. Int. J. Dev. Biol. 54, 877-886 (2010).
