シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージング<em>インビボ</em
Summary
共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。
Abstract
ミトコンドリアは、真核生物系でのエネルギー生産と細胞内シグナル伝達を担う重要な細胞内小器官である。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属の、人間の病気に貢献しています。ミトコンドリア機能および機能不全を評価するために開発されてきたアプローチの大部分は、in vitroまたはex vivoで測定に基づいている。これらの実験からの結果は、in vivoでのミトコンドリア機能を決定する上での能力が限られている。ここでは、 インビボでリアルタイムに単一ミトコンドリア機能の評価を可能にするライブアミナール中の無傷の組織のイメージング、共焦点走査顕微鏡法を用いた、新たなアプローチを記載する。まず、ミトコンドリアの対象とスーパーオキシドインジケータ、円順列黄色蛍光タンパク質（MT-cpYFP）を発現するトランスジェニックマウスを作製。麻酔をかけたMT-cpYFPマウスがカスタムメイドステージアダプタに固定され、タイムラプス画像は、Fをとっている後肢の露出骨格筋ROMをマウスはその後、犠牲にされ、心臓は37℃で、生理的なソリューションをランゲンドルフ灌流用に設定されている灌流心臓を共焦点顕微鏡ステージ上に特殊なチャンバ内に配置され、穏やかな圧力は、心臓を固定し、心拍誘導運動アーチファクトを抑制するために適用される。スーパーオキシド点滅毎秒1フレームの周波数でのリアルタイム二次元共焦点イメージングにより検出される。灌流溶液は、異なる呼吸基質または他の蛍光指示薬を含有するように修飾することができる。灌流はまた、虚血および再灌流などの疾患モデルを生成するように調整することができる。この技術は、無傷の組織およびインビボでの単一ミトコンドリアの機能を決定するためのユニークなアプローチである。
Introduction
ミトコンドリアは、細胞の生体エネルギー、フリーラジカルシグナル伝達、酸化還元ホメオスタシス、イオン調節、および細胞運命決定の1,2において中心的な役割を果たす。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属のと病気3-6の病因の基礎となる。特に、心臓や骨格筋などの筋肉のシステムでは、ミトコンドリアの呼吸は、細胞内カルシウム、堅牢な力開発7,8のタイムリーな調整を支援するために、ATPの大部分を提供します。これらの筋肉は、多くの場合、全細胞容積20〜40％まで占め、筋フィラメント2間に「固定」されたミトコンドリアの多数を持っている。
多くの研究にもかかわらず、ミトコンドリア機能調節の我々の理解は、特に生体内および生理学的に関連する条件下では、限られている。理由の一つは、ミトコンドリア機能を評価するために開発された方法の大部分はvitrに頼るあるこのような人工基質を補充した単離ミトコンドリアの酸素消費量、および間接形態学を通じてミトコンドリア機能の決定（ 例えば電子顕微鏡）、酵素活性（ 例えばアコニターゼ活性）、または細胞内ATPレベル9から11の監視などoまたはex vivoでのアプローチ、 。
最近では、相対的なミトコンドリア富化を有する小分子蛍光指示薬は、無傷の細胞における膜電位、カルシウムおよび活性酸素種（ROS）、11-13を含むミトコンドリアシグナルの姿を提供するために適用されている。さらに、いくつかの緑色蛍光タンパク質（GFP）をレドックス系、ROS指標区画化、細胞内の酸化還元またはROS 14-16信号のより具体的な評価を達成するために開発されてきた。この中でも、我々は、遺伝的にコード化されたスーパーオキシドインジケーター、円形の順列黄色蛍光タンパク質、およびtargeteを開発Dそれミトコンドリア（MT-cpYFP）17に変換する。 MT-cpYFPは、515 nmでの発光ピークの両方で405又は488nmで励起することができる。 488nm励起での発光は、 インビトロおよびインビボ較正 17,18 内の前で示すように、スーパーオキシドに特異的に応答する。 405 nm励起の発光は、（様々な条件の下で、MT-cpYFPの発光および励起スペクトルの詳細については文献[17の図1をご参照ください）内部コントロールとして使用されます。タイムラプス共焦点イメージングでは、この指標は、無傷の細胞の単一ミトコンドリア内スーパーオキシド産生のイベント、というスーパーが点滅し、破裂を検出。スーパーフラッシュは、ミトコンドリア呼吸、添付過渡ミトコンドリア膜脱分極およびROS産17〜20の合成関数として機能します。最近では、C57/BL6の背景をpUC-CAGGS-MT-cpYFPベクトル17,19を使用したパン-組織MT-cpYFPトランスジェニックマウスを作製し、強力なEXPRESを確認しました心臓、骨格筋および他の組織（ 図2）で、この指標のシオン。トランスジェニックマウスは、要求とワシントン大学のMTAの承認を得て興味を持って、学術研究者のために利用できるようになります。
本研究では、 その場でのランゲンドルフ灌流し、心臓内のスーパーオキシドが点滅の撮影だけでなく、麻酔MT-cpYFPトランスジェニックマウス17,19の骨格筋におけるFlashイベントのin vivoイメージングに説明します。この技術は、生理学的に関連する状態またはin vivo 21,22の単一ミトコンドリアのROS産生のイベントのリアルタイム監視が可能になります。このような適切な蛍光指示薬を有する膜電位およびカルシウムなどの他の単一ミトコンドリアのパラメータを監視するシステムを使用することも可能である。細胞内のイベント（ 例えば 、カルシウムトランジェント）や心臓の機能（ 例えばとミトコンドリア機能の更なる、同時またはパラレル評価。駆出率）を達成することができる。例えば、虚血および再灌流のような病理学的摂動は、無傷心筋の単一ミトコンドリア機能に対するストレスの影響を評価するために灌流心臓に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
生きた動物または灌流さの臓器の単一ミトコンドリアのイベントを画像化することは、ミトコンドリア機能評価17,19,21,22,24,25のための従来の方法に比べて大きな利点があります。ここに記載された技術は、細胞内の解像度で、実際の生理学的状態にあるミトコンドリア機能のその場での決定に 、リアルタイムを実現することができます。全身的にインビボで特定?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、博士に感謝したいと思います。和平チェン、Huiliang張とスティーブンKolwiczこの方法を開発する上で有益なコメントや技術的なサポートのため。この研究は、NIHの助成金や米国心臓協会からWWに科学者開発助成金によって支えられている。
Materials
| REAGENTS | |||
| Blebbistatin | Toronto Research Chemicals | B592500 | |
| CaCl2 | Acros Organics | AC34961-5000 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H7006-500 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541-1 | |
| MgCl2•6H2O | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | M1880-1 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282-500 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6014-1 | |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25 | |
| TMRM | Invitrogen | T-668 | |
| [header] | |||
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module. |
References
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