Imagen confocal de Soltero mitocondriales superóxido Parpadea en corazón intacto o<em> En Vivo</em

Summary

La microscopía confocal de barrido se aplica para obtener imágenes de los eventos mitocondriales individuales en el corazón perfundido o los músculos esqueléticos en animales vivos. Monitoreo en tiempo real de los procesos mitocondriales individuales, como accesos repentinos superóxido y potencial de membrana fluctuaciones permite la evaluación de la función mitocondrial en un contexto fisiológicamente relevante y durante perturbaciones patológicas.

Abstract

Mitocondria es un orgánulo intracelular crítico responsable de la producción de energía y la señalización intracelular en sistemas eucarióticos. La disfunción mitocondrial a menudo acompaña y contribuye a la enfermedad humana. La mayoría de los enfoques que se han desarrollado para evaluar la función mitocondrial y la disfunción se basa en in vitro o in vivo mediciones ex. Los resultados de estos experimentos han capacidad en la determinación de la función mitocondrial in vivo limitado. Aquí se describe un nuevo método que utiliza la microscopía confocal de barrido para la obtención de imágenes de los tejidos intactos en aminales en vivo, lo que permite la evaluación de la función mitocondrial solo de una manera en tiempo real en vivo. Primero, generamos ratones transgénicos que expresan el indicador dismutasa mitocondrial específica, la proteína fluorescente amarilla permutado circularmente (mt-cpYFP). Mt-cpYFP anestesiado ratón se fija en un adaptador de fase a medida y las imágenes con lapso de tiempo se toman fesde los músculos esqueléticos expuestas de la extremidad posterior. El ratón se sacrificó y posteriormente el corazón está configurado para perfusión Langendorff con soluciones fisiológicas a 37 ° C. El corazón perfundido se coloca en una cámara especial en la platina del microscopio confocal y se aplica una presión suave para inmovilizar el corazón y suprimir los latidos del corazón inducida artefactos de movimiento. Parpadea superóxido se detectan en tiempo real de imagen confocal en 2D a una frecuencia de un fotograma por segundo. La solución de perfusión puede ser modificado para contener diferentes sustratos de respiración u otros indicadores fluorescentes. La perfusión también se puede ajustar para producir modelos de enfermedades como la isquemia y la reperfusión. Esta técnica es un enfoque único para la determinación de la función de único mitocondria en tejidos intactos e in vivo.

Introduction

Las mitocondrias juegan un papel central en la bioenergética celular, la señalización de los radicales libres, la homeostasis redox, la regulación de iones, y la determinación del destino celular ^1,2. Las mitocondrias a menudo acompaña a la disfunción y la base de la patogénesis de las enfermedades ^3-6. Especialmente en los sistemas musculares tales como el corazón y los músculos esqueléticos, la respiración mitocondrial proporciona la mayoría de ATP para apoyar la regulación oportuna de calcio intracelular y robusto ^7,8 desarrollo de la fuerza. Estos músculos poseen un gran número de mitocondrias, que a menudo ocupan hasta un 20-40% del volumen total de células y son "fijos" entre miofilamentos ^2.

A pesar de numerosos estudios, nuestra comprensión de la regulación de la función mitocondrial, específicamente in vivo y bajo condiciones fisiológicamente pertinentes, es limitada. Una de las razones es que la mayoría de los métodos desarrollados para la evaluación de la función mitocondrial depende de en VITRO o ex enfoques in vivo, tales como el control de la consumo de oxígeno de mitocondrias aisladas suplementado con sustratos artificiales, y la determinación indirecta de la función mitocondrial a través de la morfología (microscopía de electrones por ejemplo), actividad enzimática (por ejemplo, actividad de la aconitasa), o los niveles de ATP intracelulares ^9-11 .

Recientemente, los pequeños indicadores fluorescentes de moléculas con un enriquecimiento relativo mitocondrial se han aplicado para proporcionar una visión de las señales mitocondriales, incluyendo el potencial de membrana, calcio y especies reactivas de oxígeno (ROS), en células intactas ^11-13. Por otra parte, varios proteína fluorescente verde (GFP) y redox basado en indicadores de ROS se han desarrollado para lograr una evaluación más específica de la redox intracelular de ROS compartimentada o señales de ^14-16. Entre esto, hemos desarrollado un indicador codificado genéticamente dismutasa, la proteína amarilla fluorescente circular permutada y targeted en las mitocondrias (mt-cpYFP) ^17. mt-cpYFP puede ser excitado a 405 o 488 nm con dos picos de emisión a 515 nm. La emisión a 488 nm de excitación es específicamente sensible a superóxido como se muestra por el anterior in vitro e in vivo calibraciones ^17,18. La emisión a 405 nm de excitación se utilizó como control interno (por favor refiérase a la Figura 1 de la Ref. 17 para obtener información detallada sobre la emisión y excitación espectros de mt-cpYFP en diversas condiciones). Con la imagen confocal de lapso de tiempo, este indicador detecta reventar eventos de producción de superóxido, llamados destellos superóxido, en las mitocondrias individuales de células intactas. Flash superóxido sirve como una función compuesta de la respiración mitocondrial, acompañamiento transitoria despolarización de la membrana mitocondrial y la producción de ROS ^17-20. Recientemente, hemos generado las pan-tejido mt-cpYFP ratones transgénicos utilizando el vector pUC-CAGGS-mt-cpYFP ^17,19 en C57/BL6 fondo y verificado las expresiones fuertessión de este indicador en el corazón, los músculos esqueléticos y otros tejidos (Figura 2). Los ratones transgénicos estará disponible para los investigadores académicos interesados ​​previa solicitud y aprobación MTA por la Universidad de Washington.

En este estudio, se describe en la formación de imágenes in situ de destellos superóxido en corazón Langendorff perfundidos, así como formación de imágenes in vivo de eventos de flash en los músculos esqueléticos de MT-cpYFP ratones transgénicos anestesiados ^17,19. Esta tecnología permite la monitorización en tiempo real de eventos de producción de ROS mitocondriales individuales en un estado fisiológicamente relevante o in vivo ^21,22. También es factible utilizar el sistema para controlar otros parámetros mitocondriales individuales tales como el potencial de membrana y de calcio con indicadores fluorescentes apropiados. Evaluación Además, simultánea o paralela de la función mitocondrial con eventos intracelulares (por ejemplo, los transitorios de calcio) o la función del corazón (por ejemplo,. Fracción de eyección) se puede lograr. Perturbaciones patológicas, tales como la isquemia y la reperfusión, se pueden aplicar al corazón perfundido para evaluar el impacto del estrés sobre la función mitocondrial solo en el miocardio intacto.

Protocol

1. Preparación experimental Preparar la solución isotónica salina equilibrada (50 ml) que contenía: NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 2,5 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl 2 y 10 mM de HEPES (pH 7,2) para obtener imágenes de músculo esquelético in vivo. Preparar 1 L de tampón de Krebs-Henseleit (KHB) que contiene: NaCl 118 mM, 5,3 mM de KCl, 1,2 mM de MgSO4, 0,5 mM de EDTA y 25 mM de NaHCO3. Burbuja la KHB con gas que contiene 95% de O2 …

Representative Results

De acuerdo con este protocolo, formación de imágenes in vivo de eventos mitocondriales individuales se puede hacer en los músculos esqueléticos de ratones anestesiados, seguido de formación de imágenes en situ en el corazón perfundido (Figura 1). El ajuste óptimo de las condiciones de formación de imágenes se asegurará de imágenes claras de los tejidos musculares intactas y con resolución única mitocondria (Figura 2). TMRM se utiliza a menudo para verific…

Discussion

Imaging eventos mitocondriales individuales en animales vivos o en los órganos perfundidos tiene ventaja significativa sobre los métodos tradicionales de evaluación de la función mitocondrial ^{17,19,21,22,24,25.} La técnica descrita aquí puede lograr en tiempo real en la determinación in situ de la función mitocondrial en una condición fisiológica real en la resolución subcelular. Esto es particularmente útil, cuando se combina con otras mediciones, para estudiar sistémicamente el…

Materials

			REAGENTS
Blebbistatin	Toronto Research Chemicals	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S6014-1
Pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
			[header]
			EQUIPMENT
			Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including "Physiological Analysis" module.