Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip
Summary
We hebben een microfluïdisch platform ontwikkeld voor snelle antibioticagevoeligheidstests. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën kunnen deze stressvolle omstandigheden echter overleven.
Abstract
We hebben een snelle microfluïdische methode ontwikkeld voor het testen van de gevoeligheid van antibiotica in een stressgebaseerde omgeving. Vloeistof wordt met hoge snelheden doorgegeven over bacteriën die op de bodem van een microfluïdisch kanaal zijn geïmmobiliseerd. In aanwezigheid van stress en antibiotica sterven gevoelige bacteriestammen snel af. Resistente bacteriën overleven deze stressvolle omstandigheden echter. De hypothese achter deze methode is nieuw: stressactivatie van biochemische routes, die doelwit zijn van antibiotica, kan het testen van de gevoeligheid van antibiotica versnellen. In vergelijking met standaard antibioticagevoeligheidstestmethoden wordt de snelheidsbeperkende stap – bacteriële groei – weggelaten tijdens het aanbrengen van antibiotica. De technische implementatie van de methode is in een combinatie van standaardtechnieken en innovatieve benaderingen. De standaardonderdelen van de methode omvatten bacteriële kweekprotocollen, het definiëren van microfluïdische kanalen in polydimethylsiloxaan (PDMS), cel levensvatbaarheidsmonitoring met fluorescentie en batchbeeldverwerking voor het tellen van bacteriën. Innovatieve onderdelen van de methode zijn in het gebruik van kweekmediastroom voor mechanische stresstoepassing, gebruik van enzymen om de bacteriën te beschadigen maar niet te doden, en het gebruik van microarray substraten voor bacteriële aanhechting. Het ontwikkelde platform kan worden gebruikt bij de ontwikkeling en het testen van antibiotica en niet-antibiotische geneesmiddelen. In vergelijking met de standaard bacteriële suspensie-experimenten kan het effect van het medicijn herhaaldelijk worden in- en uitgeschakeld gedurende gecontroleerde periodes. Repetitieve observatie van dezelfde bacteriepopulatie is mogelijk in de loop van hetzelfde experiment.
Introduction
De opkomst van bacteriële resistentie versterkt de behoefte aan snelle op fenotype gebaseerde antibioticagevoeligheidstests om onze geneesmiddelen in laatste instantie te beschermen. Standaard gevoeligheidstests zijn gebaseerd op bacteriële groeiremming in aanwezigheid van antibiotica die meerdere (8-24) uur in beslag nemen. We hebben een nieuwe antibioticagevoeligheidstest ontwikkeld op een microfluïdisch platform dat afhankelijk is van de stressactivering van biosyntheseroutes om de werking van antibiotica te versnellen.
Antibiotica gevoeligheidstests op microfluïdische schaal hebben het voordeel van effectief monstergebruik, omdat ze kleine aantallen bacteriën vereisen. Bovendien kunnen microfluïdische apparaten worden gemulderd om meerdere monsters onder meerdere omstandigheden te testen1,2. Onlangs zijn een aantal microfluïdische methoden voor antibioticagevoeligheidstests gemeld3-9. In deze methoden worden bacteriën gekweekt in nano- en picoliterdruppels3,7, in het volledige volume van het microfluïdische kanaal4-6,8, of als enkele bacteriën elektrisch gelokaliseerd op het onderste oppervlak van kanaal9. Hoewel deze tests worden uitgevoerd in microfluïdische kanalen, monitoren ze allemaal de microbiële groei in de aan- en afwezigheid van antibiotica die vergelijkbaar zijn met traditionele methoden. Groeimetingen worden uitgevoerd via optische dichtheid, pH-gevoelige kleurstoffen of heldere veld-/fasecontrast- of fluorescentiebeelden. Hoewel sommige van deze tests sneller zijn dan traditionele methoden, detecteren ze elk passief antibioticaresistentie. Met andere woorden, deze methoden vereisen nog steeds dat de gebruiker wacht op bacteriegroei als de laatste uitlezing.
Daarentegen hebben we een methode ontwikkeld die een combinatie van afschuiving en enzymatische stress gebruikt om antibioticagevoelige biochemische routes te activeren10. Het uitdagen van de gestreste bacteriën met die antibiotica creëert een snellere gevoeligheidstest. Bacteriën die resistent zijn tegen het antibioticum zijn bestand tegen de stressvolle omstandigheden. Gevoelige bacteriën daarentegen worden snel gedood door de gecombineerde spanningen. Het percentage celdood na een uur, gemeten door microscopie met behulp van een fluorescerende dode celvlek, definieert het fenotype van de bacterie (resistent versus vatbaar).
Voor een succesvolle implementatie van onze methode moeten bacteriën worden geïmmobiliseerd op het onderste oppervlak van het microfluïdische kanaal. Op deze manier kunnen bacteriën worden blootgesteld aan verschillende spanningen en tegelijkertijd onder een microscoop in één vlak worden afgebeeld. Een gecoate microscoopglasschuif wordt gebruikt voor bacterieimmobilisatie. De dia is door de fabrikant voorgecoat met epoxidegroepen voor niet-specifieke eiwitbinding. De aspecifieke binding van deze epoxiden aan bacteriële oppervlakte-eiwitten hecht de bacteriën covalent aan het diaoppervlak.
Stammen worden getest onder identieke omstandigheden (shear + enzymatische stress) bij afwezigheid (controle) en aanwezigheid (experiment) van antibiotica. Fasecontrast en fluorescentiemicroscoopfoto’s van elk kanaal worden gedurende een uur elke twee minuten automatisch gemaakt. Resistentiebenamingen worden vervolgens gemaakt door het percentage dode bacteriën in het experimentele kanaal te vergelijken met die in het controlekanaal. Na een uur wordt een monster met een celdoodpercentage van meer dan 1% als vatbaar beschouwd, terwijl minder dan 0,5% sterfte indicatief is voor resistentie. Percentages die tussen deze twee afsnijdingen vallen, worden als onbepaald beschouwd en het monster moet opnieuw worden getest.
Microfluïdische kanalen worden gedefinieerd in PDMS, een materiaal bij uitstek voor microfluïdische apparaten11. PDMS is optisch transparant in een breed scala aan golflengten, biocompatibel, inert, doorlaatbaar voor gassen en heeft een lage permeabiliteit voor vloeistoffen; daarom is het zeer geschikt voor deze experimenten.
Mechanische/schuifspanning wordt gecreëerd door de stroom van kamertemperatuurmedia over de geïmmobiliseerde bacteriën. (Opmerking: Het opwarmen van de media tot 37 °C heeft geen significant effect op de uitkomst van de test.) Geautomatiseerde spuitpompen forceren media (met dode celvlek +/- antibioticum, evenals optionele enzymatische stressoren) door de microfluïdische kanalen (200 μm x 400 μm) met een debiet van 1 ml/min om 6,25 kPa afschuifkracht of een afschuifsnelheid van 6.000 sec-1te geven. Dit percentage is gelijk aan of hoger dan eerder bestudeerde schuifspanningen op stafylokokken.
Het enzym, lysostaphin, werd geselecteerd voor voorbereidende experimenten omdat het directe schade aan de Staphylococcus celwand veroorzaakt. De concentratie lysostaphin (0,7 ng/ml) was voldoende om bacteriële celwandschade te veroorzaken, maar niet voldoende om bacteriële celdood zonder antibioticum te veroorzaken in het tijdsbestek van het experiment. Lysostaphin is niet nodig voor de juiste aanduiding van bacteriële gevoeligheid, maar het verhoogt wel het resultaat, wat leidt tot verhoogde celdood bij gevoelige stammen. Schuifspanning daarentegen is van cruciaal belang voor de testfunctie. Wanneer methicilline-gevoelige Staphylococcus aureus stammen worden behandeld met lysostaphin en oxacilline bij afwezigheid van stroom, wordt er in de loop van het experiment geen celdood geregistreerd.
De levensvatbaarheid van de cel wordt bewaakt met een fluorescerende dode celvlek12. De selectie van de kleurstof was gebaseerd op zijn vermogen om selectief alleen beschadigde cellen te bevlekken, de niet-toxiciteit voor levende cellen en de lage fluorescentie op de achtergrond, waardoor de directe toevoeging aan de celmedia zonder extra stappen mogelijk was. De selectie van een fluorescerende kleurstofconcentratie van 0,25 μM was om aanvaardbare signaalniveaus te bereiken tijdens een blootstellingstijd van 1,6 sec aan fluorescentie-excitatielicht.
De bèta-lactam, oxacilline, werd gebruikt in onze voorstudies. Methicilline-resistente S. aureus (MRSA) soorten zijn resistent tegen oxacilline en zullen in het tijdsbestek van het experiment geen merkbare celdood vertonen. De concentratie van 50 μg/ml werd bepaald in de voorstudies. Lagere concentraties antibiotica gaven minder scheiding tussen resistente en gevoelige stammen, terwijl hogere concentraties geen merkbaar verschil in experimentele resultaten veroorzaakten.
We hebben eerder gerapporteerd over de succesvolle ontwikkeling van een test die mechanische en enzymatische spanningen combineert die de bacteriële celwand13 rechtstreeks beïnvloeden met een antibioticum dat de biosynthese van de celwand remt14,15. Deze proof-of-principle experimenten werden uitgevoerd op een panel van MRSA en methicilline-gevoelige S. aureus (MSSA). Met de selectie van de juiste experimentele parameters moet onze methode echter van toepassing zijn op meerdere soorten bacteriën en meerdere klassen antibiotica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol werd gevalideerd en geoptimaliseerd in een reeks experimenten met methicillinegevoelige en methicillineresistente Staphylococcus aureus stammen10. Daarom moet dit protocol zonder wijziging rechtstreeks van toepassing zijn op andere stammen van S. aureus en andere antibiotica met werkingsmechanismen die de biosynthese van de bacteriële celwand beïnvloeden. Andere bacterietypen dan S. aureus kunnen variatie in de stressparameters vereisen: oplosbare (enzym…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken de ingenieurs en studenten van het Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Voor het helpen bij het ontwerp, de bewerking en de automatisering van het experimentele systeem, bedanken we Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin en Dr. Sudong Shu. We danken Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu en Katarzyna Kuliga voor hulp bij het testen van experimentele protocollen en het verzamelen van gegevens. We erkennen Drs. Anne E. Carpenter en Mark-Anthony Bray van het Imaging Platform van het Broad Institute of Harvard en MIT voor hulp bij de ontwikkeling van de beeldanalyseroutine in CellProfiler. Het beschreven project werd gedeeltelijk ondersteund door awards R21AI079474 en 1R01AI101446 van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases of de National Institutes of Health. Het project werd ook ondersteund door Fraunhofer USA.
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
References
- Mairhofer, J., Roppert, K., Ertl, P. Microfluidic systems for pathogen sensing: a review. Sensors. 9, 4804-4823 (2009).
- Yager, P., et al. Microfluidic diagnostic technologies for global public health. Nature. 442, 412-418 (2006).
- Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics. Lab Chip. 8, 1265-1272 (2008).
- Cao, J., et al. Uncovering toxicological complexity by multi-dimensional screenings in microsegmented flow: modulation of antibiotic interference by nanoparticles. Lab Chip. 12, 474-484 (2012).
- Chen, C. H., et al. Antimicrobial susceptibility testing using high surface-to-volume ratio microchannels. Anal. Chem. 82, 1012-1019 (2010).
- Churski, K., et al. Rapid screening of antibiotic toxicity in an automated microdroplet system. Lab Chip. 12, 1629-1637 (2012).
- Eun, Y. J., Utada, A. S., Copeland, M. F., Takeuchi, S., Weibel, D. B. Encapsulating bacteria in agarose microparticles using microfluidics for high-throughput cell analysis and isolation. ACS Chem. Biol. 6, 260-266 (2011).
- Kim, K. P., et al. In situ monitoring of antibiotic susceptibility of bacterial biofilms in a microfluidic device. Lab Chip. 10, 3296-3299 (2010).
- Peitz, I., van Leeuwen, R. Single-cell bacteria growth monitoring by automated DEP-facilitated image analysis. Lab Chip. 10, 2944-2951 (2010).
- Kalashnikov, M., Lee, J. C., Campbell, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. A microfluidic platform for rapid, stress-induced antibiotic susceptibility testing of Staphylococcus aureus. Lab Chip. 12, 4523-4532 (2012).
- McDonald, J. C., Whitesides, G. M. Poly(dimethylsiloxane) as a material for fabricating microfluidic devices. Acc. Chem. Res. 35, 491-499 (2002).
- Roth, B. L., Poot, M., Yue, S. T., Millard, P. J. Bacterial viability and antibiotic susceptibility testing with SYTOX green nucleic acid stain. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2421-2431 (1997).
- Francius, G., Domenech, O., Mingeot-Leclercq, M. P., Dufrene, Y. F. Direct observation of Staphylococcus aureus cell wall digestion by lysostaphin. J. Bacteriol. 190, 7904-7909 (2008).
- Jordan, S., Hutchings, M. I., Mascher, T. Cell envelope stress response in Gram-positive bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32, 107-146 (2008).
- Koch, A. L. Bacterial wall as target for attack: past, present, and future research. Clin. Microbiol. Rev. 16, 673-687 (2003).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, R100 (2006).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. Nat. Rev. Microbiol. 8, 423-435 (2010).
- Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Hayete, B., Lawrence, C. A., Collins, J. J. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. Cell. 130, 797-810 (2007).
