Test di suscettibilità agli antibiotici indotti dallo stress su un chip
Summary
Abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica per test di suscettibilità agli antibiotici rapidi. Il fluido viene passato ad alta velocità sui batteri immobilizzati sul fondo di un canale microfluidico. In presenza di stress e antibiotici, i ceppi sensibili di batteri muoiono rapidamente. Tuttavia, i batteri resistenti possono sopravvivere a queste condizioni stressanti.
Abstract
Abbiamo sviluppato un metodo microfluidico rapido per i test di suscettibilità agli antibiotici in un ambiente basato sullo stress. Il fluido viene passato ad alta velocità sui batteri immobilizzati sul fondo di un canale microfluidico. In presenza di stress e antibiotici, i ceppi sensibili di batteri muoiono rapidamente. Tuttavia, i batteri resistenti sopravvivono a queste condizioni stressanti. L’ipotesi alla base di questo metodo è nuova: l’attivazione dello stress delle vie biochimiche, che sono obiettivi di antibiotici, può accelerare i test di suscettibilità agli antibiotici. Rispetto ai metodi standard di test di suscettibilità agli antibiotici, il passaggio di limitazione del tasso – crescita batterica – viene omesso durante l’applicazione di antibiotici. L’implementazione tecnica del metodo è in una combinazione di tecniche standard e approcci innovativi. Le parti standard del metodo includono protocolli di coltura batterica, definendo canali microfluidici in polidimetilsassano (PDMS), monitoraggio della vitalità cellulare con fluorescenza e elaborazione delle immagini batch per il conteggio dei batteri. Parti innovative del metodo sono nell’uso del flusso dei mezzi di coltura per l’applicazione di sollecitazioni meccaniche, nell’uso di enzimi per danneggiare ma non uccidere i batteri e nell’uso di substrati microarray per l’attacco batterico. La piattaforma sviluppata può essere utilizzata nello sviluppo e nei test di farmaci correlati agli antibiotici e non antibiotici. Rispetto agli esperimenti standard di sospensione batterica, l’effetto del farmaco può essere acceso e disattivato ripetutamente durante i periodi di tempo controllati. L’osservazione ripetitiva della stessa popolazione batterica è possibile nel corso dello stesso esperimento.
Introduction
L’aumento della resistenza batterica intensifica la necessità di test di suscettibilità agli antibiotici a base di fenotipo veloce al fine di salvaguardare i nostri farmaci di ultima istanza. I test di suscettibilità standard si basano sull’inibizione della crescita batterica in presenza di antibiotici che prendono più (8-24) ore per essere completati. Abbiamo sviluppato un nuovo test di suscettibilità agli antibiotici su una piattaforma microfluidica che si basa sull’attivazione dello stress delle vie biosintetiche per accelerare l’azione degli antibiotici.
I test di suscettibilità agli antibiotici su scala microfluidico comportano il vantaggio di un uso efficace del campione, poiché richiedono un piccolo numero di batteri. Inoltre, i dispositivi microfluidici possono essere multiplexati per testare più campioni in più condizioni1,2. Recentemente, sono stati riportati diversi metodi microfluidici per i test di suscettibilità agli antibiotici3-9. In questi metodi, i batteri vengono coltivati all’interno di goccioline nano e picoliter3,7, nell’intero volume del canale microfluidico4-6,8, o come singoli batteri localizzati elettricamente sulla superficie inferiore del canale9. Sebbene questi test siano eseguiti in canali microfluidici, tutti monitorano la crescita microbica in presenza e assenza di antibiotici simili ai metodi tradizionali. Le misurazioni della crescita vengono effettuate tramite densità ottica, coloranti sensibili al pH o immagini a contrasto campo/fase luminoso o fluorescenza. Sebbene alcuni di questi test siano più veloci dei metodi tradizionali, ciascuno rileva passivamente la resistenza agli antibiotici. In altre parole, questi metodi richiedono ancora all’utente di attendere la crescita batterica come lettura finale.
Al contrario, abbiamo sviluppato un metodo che utilizza una combinazione di taglio e stress enzimatico per attivare vie biochimiche sensibili agli antibiotici10. Sfidare i batteri stressati con quegli antibiotici crea un test di suscettibilità più rapido. I batteri resistenti all’antibiotico sono in grado di resistere alle condizioni stressanti. I batteri sensibili, d’altra parte, vengono rapidamente uccisi dalle sollecitazioni combinate. La percentuale di morte cellulare dopo un’ora, misurata per microscopia utilizzando una macchia fluorescente a cellule morte, definisce il fenotipo dei batteri (resistente vs suscettibile).
Per un’implementazione riuscita del nostro metodo, i batteri devono essere immobilizzati sulla superficie inferiore del canale microfluidico. In questo modo, i batteri possono essere sottoposti a varie sollecitazioni e simultaneamente immagini al microscopio in un unico piano. Un vetrino al microscopio rivestito viene utilizzato per l’immobilizzazione dei batteri. Lo scivolo è prerivestito dal produttore con gruppi di epossossido per il legame proteico non specifico. Il legame non specifico di questi epossidi alle proteine superficiali batteriche attacca covalentemente i batteri alla superficie dello scivolo.
I ceppi sono testati in condizioni identiche (taglio + stress enzimatico) in assenza (controllo) e presenza (esperimento) di antibiotico. Il contrasto di fase e le immagini al microscopio a fluorescenza di ciascun canale vengono scattate automaticamente ogni due minuti per un’ora. Le designazioni di resistenza vengono quindi effettuate confrontando la percentuale di batteri morti nel canale sperimentale con quelli presenti nel canale di controllo. Dopo un’ora, un campione con una percentuale di morte cellulare superiore all’1% è considerato suscettibile, mentre meno dello 0,5% della morte è indicativo di resistenza. Le percentuali che rientrano tra questi due cut-off sono considerate indeterminate e il campione deve essere nuovamente testato.
I canali microfluidici sono definiti in PDMS, che è un materiale di scelta per i dispositivi microfluidici11. Il PDMS è otticamente trasparente in un’ampia gamma di lunghezze d’onda, biocompatibile, inerte, permeabile ai gas e ha una bassa permeabilità ai liquidi; pertanto è adatto per questi esperimenti.
La sollecitazione meccanica/di taglio è creata dal flusso di mezzi a temperatura ambiente sui batteri immobilizzati. (Nota: riscaldare il supporto a 37 °C non ha alcun effetto significativo sull’esito del saggio.) Le pompe automatiche per siringhe forzano i mezzi (contenenti macchie cellulari morte +/- antibiotico, nonché fattori di stress enzimatici opzionali) attraverso i canali microfluidici (200 μm x 400 μm) ad una portata di 1 ml/min per dare 6,25 kPa di forza di taglio o una velocità di taglio di 6.000 sec-1. Questo tasso è uguale o superiore alle sollecitazioni di taglio precedentemente studiate sugli Staphylococci.
L’enzima, lisostafina, è stato selezionato per esperimenti preliminari perché causa danni diretti alla parete cellulare dello Stafilococco. La concentrazione di licostafina (0,7 ng/ml) è stata sufficiente a causare danni alle pareti cellulari batteriche, ma non sufficiente a causare la morte delle cellule batteriche senza antibiotico nei tempi dell’esperimento. La licostaphin non è necessaria per la corretta designazione della suscettibilità batterica, ma aumenta il risultato, portando ad un aumento della morte cellulare nei ceppi sensibili. Al contrario, la sollecitazione di taglio è fondamentale per la funzione di dosaggio. Quando i ceppi di Staphylococcus aureus sensibili alla meticillina vengono trattati con lisostafina ed oxacillina in assenza di flusso, non viene registrata alcuna morte cellulare nel corso dell’esperimento.
La vitalità cellulare è monitorata con una macchia fluorescente a cellulemorte 12. La selezione del colorante era basata sulla sua capacità di macchiare selettivamente solo le cellule danneggiate, la sua non tossicità per le cellule vive e la sua bassa fluorescenza di fondo, che ne consentiva l’aggiunta diretta al supporto cellulare senza ulteriori passaggi. La scelta di una concentrazione di colorante fluorescente di 0,25 μM doveva raggiungere livelli di segnale accettabili durante un tempo di esposizione di 1,6 secondi alla luce di eccitazione a fluorescenza.
Il beta-lattame, oxacillina, è stato utilizzato nei nostri studi preliminari. Le specie S. aureus (MRSA) resistenti alla meticillina sono resistenti all’oxacillina e non mostreranno alcuna morte cellulare apprezzabile nel periodo di tempo dell’esperimento. La concentrazione di 50 μg/ml è stata determinata negli studi preliminari. Concentrazioni più basse di antibiotici hanno dato meno separazione tra ceppi resistenti e sensibili, mentre concentrazioni più elevate non hanno causato una differenza apprezzabile nei risultati sperimentali.
In precedenza abbiamo riferito del successo dello sviluppo di un test che combina sollecitazioni meccaniche ed enzimatiche che influenzano direttamente la parete cellularebatterica 13 con un antibiotico che inibisce la biosintesi della paretecellulare 14,15. Questi esperimenti di prova di principio sono stati effettuati su un gruppo di MRSA e S. aureus (MSSA) sensibili alla meticillina. Tuttavia, con la selezione di parametri sperimentali adeguati, il nostro metodo dovrebbe essere applicabile a più specie di batteri e più classi di antibiotici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato è stato convalidato e ottimizzato in una serie di esperimenti con ceppi stafilococco aureo sensibili alla meticillina e resistenti alla meticillina10. Pertanto, questo protocollo senza modifiche dovrebbe essere direttamente applicabile ad altri ceppi di S. aureus e altri antibiotici con meccanismi d’azione che influenzano la biosintesi della parete cellulare batterica. Tipi di batteri diversi da S. aureus possono richiedere variazioni nei parametri di sollec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo gli ingegneri e gli studenti del Fraunhofer Center for Manufacturing Innovation. Per aver contribuito alla progettazione, lavorazione e automazione del sistema sperimentale, ringraziamo Andreas Prinzen, Holger Wirz, Doug Foss, David Chargin e il Dr. Sudong Shu. Ringraziamo Julia Kuckartz, Melanie Zimmermann, Niko Kraetzmar, Tim Gumbel, Josh Villanueva, Minori Shimizu e Katarzyna Kuliga per l’aiuto nel test dei protocolli sperimentali e nella raccolta dei dati. Prendiamo atto della dott.ssa Anne E. Carpenter e di Mark-Anthony Bray della piattaforma di imaging presso il Broad Institute di Harvard e il MIT per l’aiuto nello sviluppo della routine di analisi delle immagini in CellProfiler. Il progetto descritto è stato sostenuto in parte dai Premi R21AI079474 e 1R01AI101446 del National Institute of Allergy and Infectious Diseases. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali dell’Istituto Nazionale di Allergia e Malattie Infettive o degli Istituti Nazionali di Salute. Il progetto è stato sostenuto anche da Fraunhofer USA.
Materials
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | Dead cell fluorescence stain |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | Used for lysostaphin storage |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | Used for lysostaphin storage |
| Lysostaphin | Cell Sciences | CRL309A | Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 µg/ml lysostaphin for storage |
| Oxacillin salt | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | Antibiotic |
| Mueller Hinton Broth | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving |
| 1 ml, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz, Luer-lock syringe | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 – 60 mL | Overfill to ~65 ml |
| Microscope | |||
| Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60X, Fluorescence/Phase contrast objective | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12-bit monochrome CCD camera | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| Microscope automation | |||
| Shutters phase contrast/fluorescence | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y Stage | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| Focus motor | PRIOR Scientific | H122 | |
| Joystick for XYZ control | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan Controller | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| Image Acquisition Software | Fraunhofer CMI | ||
| Flow Cell Assembly and PDMS | |||
| Flow Cell | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI |
| Glass window | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI |
| BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| Sealing plate | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| Epoxide glass slide | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS master | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine) |
| PDMS slide design | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| Tubing | |||
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green | IDEX Health & Science | M-644-03 | Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule |
| Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black | IDEX Health & Science | M-657 | |
| Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural | IDEX Health & Science | P-255 | |
| Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow | IDEX Health & Science | P-259 | Fits Luer-lock adapter |
| Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green | IDEX Health & Science | 1520G | |
| Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red | IDEX Health & Science | P-658 |
References
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