הצלה של וירוס רקומביננטי ניוקאסל מחלות מcDNA

Summary

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), נחקר בהרחבה בשנים האחרונות על מנת לפתח וקטורים חדשים לחיסון וטיפול, בין יתר. מחקרים אלה היו אפשריים בשל טכניקות להצלת וירוס רקומביננטי מcDNA, כמו אלה שאנו מתארים כאן.

Abstract

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), חבר אב הטיפוס של סוג Avulavirus של המשפחה ¹ Paramyxoviridae, הוא שאינם מפולח תחושה שלילית,, חד גדילים, עטף וירוס RNA (איור 1) עם יישומים פוטנציאליים כוקטור לחיסון ו טיפול במחלות אנושיות. חקירה לעומק של יישומים אלה הפכה להיות אפשרית רק לאחר הקמתה של טכניקות גנטיקה הפוכה כדי להציל וירוסי רקומביננטי מפלסמידים קידוד הגנום המלא שלהם כcDNA ^2-5. cDNA הנגיפי יכול להיות שונה בנוחות במבחנה באמצעות נהלי שיבוט סטנדרטיים לשנות את גנוטיפ של הווירוס ו / או לכלול יחידות תעתיק חדשות. הצלה של וירוסים מהונדסים גנטי כזה מספקת כלי רב ערך כדי להבין את הגורמים המשפיעים על שלבים רבים של זיהום, כמו גם מאפשר פיתוח והשיפור של וקטורים לביטוי והאספקה ​​של אנטיגניםלחיסון וטיפול. כאן אנו מתארים פרוטוקול להצלת NDVs רקומביננטי.

Introduction

נגיף מחלת ניוקאסל (NDV), paramyxovirus עופות המשתייכים לסוג Avulavirus ^1, הוא סוכן zoonotic כלכלי רלוונטי ובכך נחקר באופן נרחב ומעקבים, אשר באופן חמור יכול להשפיע על גידול עופות בכל רחבי העולם. למרות שלא הפתוגן אנושי, NDV גם נחקר ביסודיות מעבר לשדה הווטרינר הן כparamyxovirus מודל ובשל המאפיינים שלה מעניינים מאוד, הטבעיים oncolytic ^6. מחקר על NDV תועלת רב מהפיתוח של טכניקות גנטיקה הפוכה לוירוסים חד גדילים, שאינם מפולחים תחושה השלילית RNA, שתוארו לראשונה על ידי וירוס כלבת Conzelmann וcoleagues ^2. מגוון של NDVs מהונדס גנטי, שנשא גנים או שינויים של הגנום הסוג הבר זרים נחקרו בהרחבה מאז. עבודה עם וירוסי רקומביננטי אלה הייתה קריטית כדי לאפיין גורמים ארסי שונים, לא רק של NDV אלא גם של הומא הרלוונטי האחרn פתוגנים כמו שפעת ⁷ וירוס – וירוס Nipah או מתהווה ^8. יתר על כן, מספר מחקרים שונים בחנו את השימוש בטכניקות הללו כדי לשפר את פעילות antitumoral המולדת של NDV ^6,9,10, בעיקר על ידי שיפור מאפייני immunostimulatory של הנגיף. אזור רלוונטי אחר של מחקר על NDVs רקומביננטי היה הדור של מועמדי חיסון נגד מחלות ויראליות אחרות כמו שפעת ^{5,11,12, 13} איידס, חצבת ^{14, 15} סארס, או שנגרם על ידי נגיף sincytial הנשימה (RSV) ^16. בין היתרונות הבולטים השונים הניתנים על ידי NDV הם חוסר החסינות קיימת מראש באוכלוסיות אנושיות, היציבות מוסיף חוץ גנטי, חוסר פעילות recombinatory וכולל פרופיל בטיחות גבוה בשילוב עם מאפייני immunostimulatory הטבעיים האמורים ^17. זה גם ראוי לציון השימוש הפוטנציאלי של חיסונים דו ערכי רקומביננטי בעמ 'oultry, שפעת עופות מגנה מפני שני NDV ופתוגניים מאוד וירוסי ^11,12. זו עשויה להיות דרך מצוינת כדי להפחית את הסיכויים של האחרון מתפשטים מטבע לבעלי חיים מבויתים, ובכך גם עוזרים למנוע קפיצת היתר ספציפית אפשרית של שפעת עופות חשש לבני אדם. לבסוף, NDV-להביע כתב היה בשימוש להערכה של תגובות חיסוניים מולדים, כמו גם זיהוי של אנטגוניסט אינטרפרון המקודד על ידי וירוסים מרובים ^18-27.

תהליך ההצלה של רקומביננטי, שאינו מפולח, נגיף RNA שלילי תקוע בעצם מורכב באופן מלאכותי מאלץ את מחזור שכפול נגיפי בתא ייצור על ידי transfecting קידוד cDNA המכונות מינימליות התולעת מולקולרית, המכונים ribonucleoprotein או RNP (איור 2). RNPs מורכב של פולימראז הנגיפי (P וחלבונים L), nucleoprotein (NP) ורנ"א antigenomic באורך המלא של הנגיף. RNA + antigenome זו הוא התבנית דואר הנדרשת עבור הדור של RNA-הגנום המשלים, אשר, קשור גם עם שאר החלבונים של RNP הנגיפי, משחזרת את אותו מורכב מדבק שנגיף טבעי ישחרר בציטופלסמה של התא על זיהום (איור 2A ). משלב זה ואילך, המחזור הנגיפי יכול להמשיך באופן טבעי וויריונים רקומביננטי, encapsidating גנומים שונה, יופקו (איור 2). למרבה הפלא, transfection של cDNA גנומי במקום cDNA antigenomic מאוד פוגע או לחלוטין מבטל את יעילות הצלת ^2,28-30. גם כאשר cDNA antigenomic הוא transfected, את היעילות של encapsidation של RNA רקומביננטי לRNPs בתאי transfected היא כנראה נמוכה מאוד. בגלל זה, פרוטוקולי הצלה לNDV לעתים קרובות כוללים צעדים שונים להגברה של כמה חלקיקים נגיפיים שוחררו מתאי transfected במקור על ידי coculturing אותם עם תאים מתירנית ו / או על ידיזיהום של ביצי embryonated.

לפני ההצלה, ניתן להשפיע cDNA על ידי נהלי שיבוט סטנדרטיים על מנת ליצור את השינויים הרצויים. בעוד מוטציות ספציפיות של מוצרי גן השונים ורצפים רגולטוריים של הנגיף יכולות להיות מושגת בדרך זו בצורה ישירה, רבים של העבודה שפורסמה מעורבת NDV רקומביננטי דרש תוספת של יחידת תעתיק חדשה לתוך הגנום NDV. כמו חברים אחרים במשפחת paramyxovirus, הגנום מקודד NDV שמונה חלבונים שונים לשש יחידות תעתיק, אשר באות לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בהתאם למיקום שלהם ביחס לסוף '3 ​​בשיפוע יורד קריטי עבור מחזור החיים הנגיפי ^1. בגלל זה, את המיקום של יחידת תעתיק החדשה בתוך הגנום חייב להיות שנבחר בקפידה כדי להשיג איזון בין הביטוי של transgene וירידת הערך של שכפול נגיפי. הכנסה בין P וגני M כבר בשימוש, לא הכיאתרים אחרים האף גם נבדקו ^13,31.

לא משנה מה להוסיף, השיבוט לNDV cDNA צריך לעקוב אחר כמה כללים כדי ליצור מבנה rescuable: (i) כל גן חדש שייכלל לתוך הגנום NDV צריך להיות תחת שליטה של ​​האותות המתאימים לRNA תלוי-RNA הנגיפי פולימראז. רצפים אלה יש להוסיף במעלה הזרם של מסגרת הקריאה הפתוחה החדשה (ORF) כך פולימראז יכול לזהות את הסוף של הגן הקודם (GE) ותחילתו של transgene החדש (GS), במרווחים של רצף intergenic נוקלאוטיד יחיד (IG) . תוספת של קוזאק תקף (K) רצף כדי לשפר את תרגום ריבוזומלי אוקריוטים מומלץ גם לחלבון זר ביטוי טוב יותר ³² (ii) שכפול יעיל של NDV, כמו עבור רוב בני משפחת Paramyxoviridae, תלוי באורך הגנום להיות מרובה של שש ^33, ולכן כל כניסה לתוך NDV יש לעקוב "השלטון של שש" הזה. במידת צורך, reqניתן להוסיף נוקלאוטידים נוספים uired מורד הזרם ORF החדש, וכן (iii) את הרצף של transgene צריך להיבדק כדי למצוא אפשרי GE ו GS כמו רצפים אשר עלול לפגוע ביעילות הצלה, ביטוי transgene ו / או כדאיות וירוס. אם קיימים, רצפים אלה יש להסיר על ידי mutagenesis השקט. הדור של cDNA באורך המלא רקומביננטי הבא כללים הנ"ל הוא הצעד הראשון כדי לייצר ביעילות NDV מהונדס גנטי כמפורט כאן.

במערכת כל בונה DNA נמצא תחת שליטה של אמרגן פולימראז T7-RNA (איור 3). פולימראז cytoplasmic זה מסופק בטרנס ידי coinfection עם vaccinia וירוס אנקרה הותאם רקומביננטי (MVA-T7) ^34. איור 3 א מציג את פלסמיד pNDV-B1, אשר מקודד cDNA antigenomic באורך מלא ^5. איור 3 ב מציג פלסמידים pTM1 קידוד NP, ORFs P ו-L. פלסמידים pCITE-GFP, אשר מקודד, under אמרגן T7, החלבון פלואורסצנטי הירוק (GFP), וpCAGGS GFP ^18, אשר מקודד באותו ORF תחת האמרגן אקטין בטא עוף ^35, משמשים כקבוצת ביקורת. בפרוטוקול זה אנו מציגים את ההליך כדי להציל NDV רקומביננטי מcDNA של B1 lentogenic NDV Hitchner זן ⁵ (איור 4).

Protocol

1. הכנת תאי יונקים (איור 4A, יום 1) פיצול הפ-2 או A549 תאי היום לפני transfection ב6 גם צלחות. צפיפות של התאים צריכה להגיע למפגש 80-90% ביום שלמחרת. בדרך כלל, 100 מנה מ"מ מחוברות ניתן לפצל 8 בארות (בסביבות 1 x 10 6 תאים לכל טוב). שליציל את כל וירוס, י…

Representative Results

הצלה של NDV היא הליך מבוסס היטב, מבוצע באופן שיגרתי במעבדות שיש להם גישה לcDNA של הנגיף השלם. עם זאת, הטבע סטוכסטיים המהותי של השיטה הופך אותו לקשה להשגה 100% יעילות הצלה. ניטור השלבים המוקדמים של התהליך, במיוחד את יעילות transfection והזיהום עם MVA-T7, מסייע בזיהוי בעיות אפשריות. <stro…

Discussion

מספר גורמים שיש להתחשב על מנת להשיג תוצאות טובות בזמן הצלת NDV. ראשית, מבנה cDNA באורך מלא כדי לשמש צריך להיות מתוכנן כדי לאפשר את השילוב הפונקציונלי של transgenes / השינויים החדשים לתוך הגנום NDV. משמעות דבר היא, כאמור לעיל, שרצפי הסוף (i) מתאים גנטית (GE), intergenic (IG) ותחילת גן (GS) הם ש?…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.