Resgate de Vírus da Doença de Newcastle recombinante de cDNA

Summary

O vírus da doença de Newcastle (NDV) tem sido extensivamente estudada nos últimos anos de forma a desenvolver novos vectores para a vacinação e a terapia, entre outros. Estes estudos têm sido possível devido às técnicas para resgatar vírus recombinante a partir do cDNA, tais como aqueles aqui descrita.

Abstract

O vírus da doença de Newcastle (VDN), o membro protótipo do gênero Avulavirus da família Paramyxoviridae ^1, é um não-segmentado, negativo-sentido, de fita simples, envolto vírus RNA (Figura 1) com potenciais aplicações como um vetor para a vacinação e tratamento de doenças humanas. Exploração em profundidade dessas aplicações só se tornou possível após o estabelecimento de técnicas de genética reversa para resgatar vírus recombinantes de plasmídeos que codificam seus genomas completos como cDNA ^2-5. ADNc viral pode ser convenientemente modificado, in vitro, utilizando procedimentos de clonagem padrão para alterar o genótipo do vírus e / ou para incluir novas unidades de transcrição. Resgate de tais vírus geneticamente modificados fornece uma ferramenta valiosa para entender os fatores que afetam vários estágios da infecção, bem como permite o desenvolvimento e aperfeiçoamento de vetores para a expressão e entrega de antígenospara a vacinação e terapia. Aqui nós descrevemos um protocolo para o resgate de NDVs recombinantes.

Introduction

O vírus da doença de Newcastle (VDN), um paramyxovirus aviária pertencente ao gênero Avulavirus ^1, é um agente zoonótico economicamente relevante e, portanto, amplamente pesquisados ​​e vigiado, o que pode afetar gravemente a avicultura em todo o mundo. Embora não seja um patógeno humano, NDV também tem sido minuciosamente estudados para além do campo veterinário tanto como um modelo paramyxovirus e, devido às suas propriedades muito interessantes, oncolíticos naturais ^6. Pesquisa sobre NDV beneficiaram com o desenvolvimento de técnicas de genética reversa para, não-segmentadas vírus de RNA de sentido negativo de fita simples, primeiro descrito para o vírus da raiva por Conzelmann e coleagues ^2. Uma variedade de NDVs geneticamente modificados, portadores de genes ou modificações de seu tipo selvagem genoma estrangeiros têm sido amplamente estudado desde então. Trabalhar com estes vírus recombinantes tem sido fundamental para caracterizar diferentes fatores de virulência, não só de NDV, mas também de outros huma relevanten patógenos, como vírus da gripe A ⁷ – ou o emergente Nipah vírus ^8. Além disso, um certo número de diferentes estudos têm explorado o uso destas técnicas para melhorar a actividade anti-tumoral inato de NDV ^6,9,10, na maior parte, aumentando as propriedades imunoestimulantes dos vírus. Outra área relevante da pesquisa sobre NDVs recombinantes tem sido a geração de vacinas candidatas contra outras doenças virais, como a gripe ^{5,11,12, 13} de HIV, sarampo ^14, SARS ^15, ou que causada pelo vírus sincytial respiratório (RSV) ^16. Entre as várias vantagens notáveis ​​fornecidas por NDV são a ausência de imunidade preexistente em populações humanas, a estabilidade das inserções estrangeiras genéticas, falta de actividade recombinatórios e um perfil de segurança global elevada combinada com as acima mencionadas propriedades imunoestimulantes naturais ^17. Também é digno de nota o uso potencial de vacinas bivalentes recombinantes em poultry, a gripe aviária de proteção tanto contra NDV e altamente patogênico vírus ^11,12. Esta pode ser uma excelente maneira de diminuir as chances de o último espalhamento de selvagem a animais domesticados, contribuindo assim para evitar um possível salto inter-específica da gripe aviária temida para os seres humanos. Finalmente, o NDV-expressando repórter têm sido utilizados para a avaliação de respostas imunitárias inatas, bem como a identificação de antagonistas de interferão codificado por vários vírus ^18-27.

O processo de salvamento de uma forma recombinante, não segmentado, vírus de RNA de cadeia negativa consiste basicamente em forçar artificialmente um ciclo de replicação viral de uma célula produtora por transfecção de ADNc que codificam a maquinaria molecular infecciosa mínima, conhecido como ribonucleoproteína ou RNP (Figura 2). Os RNPs consistem em a polimerase viral (P e proteínas G), a nucleoproteína (NP) e o comprimento total de ARN antigenómico de vírus. Este RNA + antigenoma é thMolde e necessária para a geração dos genomas de ARN-complementares, as quais, também associados com o resto das proteínas da RNP virai, recapitula o mesmo complexo que um vírus infeccioso natural seria libertar no citoplasma da célula após a infecção (Figura 2A ). A partir deste passo em diante, o ciclo viral pode continuar naturalmente e os viriões recombinantes, encapsidar os genomas modificados, irá ser gerado (Figura 2B). Notavelmente, a transfecção de ADNc genómico, em vez do ADNc antigenï prejudica grandemente ou elimina completamente a eficiência de recuperação ^2,28-30. Mesmo quando cDNA antigenï é transfectada, a eficiência da encapsidação do ARN recombinante em RNPs em células transfectadas é provavelmente muito baixo. Devido a isso, os protocolos de salvamento para NDV geralmente incluem diferentes passos para a amplificação das poucas partículas virais libertadas das células originalmente transf por coculturing los com células permissivas e / ou pelainfecção de ovos embrionados.

Antes da recuperação, o cDNA pode ser manipulado por procedimentos de clonagem convencionais, de modo a gerar as modificações desejadas. Embora as mutações específicas dos diferentes produtos de genes e sequências reguladoras dos vírus pode ser directamente obtida desta maneira, muitos dos trabalhos publicados envolvendo NDV recombinante foi necessária a adição de uma nova unidade de transcrição no genoma de NDV. Como outros membros da família dos paramixovírus, o genoma de NDV codifica oito proteínas diferentes em seis unidades de transcrição, que são diferencialmente expressos em função da sua localização relativamente à extremidade 3 'de um gradiente decrescente crítico para o ciclo de vida do vírus ^1. Devido a isso, o local da nova unidade de transcrição dentro do genoma deve ser cuidadosamente escolhida para alcançar um equilíbrio entre a expressão do transgene e insuficiência de replicação viral. Inserção entre os genes P e M tem sido o mais usado, toutros sites Hough também foram testados ^13,31.

Seja qual for a inserção, a clonagem de cDNA para o NDV tem de seguir algumas regras para gerar um constructo rescuable: (i) qualquer novo gene a ser incluída dentro do genoma de NDV tem de estar sob o controlo dos sinais adequados para o vírus de ARN dependente de ARN- polimerase. Estas sequências devem ser adicionado a montante da nova estrutura de leitura aberta (ORF), de modo a polimerase pode reconhecer o fim do gene anterior (GE) e o início da nova transgene (GS), espaçadas por uma única sequência de nucleótidos intergénica (IG) . A adição de uma Kozak válido (K) de sequência para melhorar a tradução ribossomal eucariótica, também é recomendado para uma melhor expressão da proteína externa ^{de 32,} (ii) uma replicação eficiente de NDV, assim como para a maioria dos membros da família Paramyxoviridae, é dependente do comprimento do genoma sendo múltiplo de seis ^{de 33} e, portanto, qualquer inserção na NDV tem que seguir essa "regra de seis". Se necessário, reqnucleotídeos adicionais uired podem ser adicionados a jusante da nova ORF, e (iii) a seqüência do transgene devem ser verificadas para encontrar possíveis GE e GS como sequências que possam prejudicar a eficiência de recuperação, a expressão do transgene e / ou viabilidade vírus. Se presente, estas sequências devem ser removidas por mutagénese silenciosa. A geração de cDNA de comprimento total recombinante a seguir regras acima referidas é o primeiro passo para produzir eficientemente um NDV geneticamente modificado tal como descrito aqui.

No sistema de todas as construções de ADN está sob o controlo do promotor da polimerase de ARN de T7 (Figura 3). Esta polimerase citoplasmática é fornecido em trans pela co-infecção com um recombinante de vaccinia modificado Ankara vírus (MVA-T7) ^34. Figura 3A mostra o plasmídeo pNDV-B1, que codifica o ADNc de comprimento completo antigenï ^5. Figura 3B mostra os plasmídeos pTM1 codificando NP, P e L ORF. Os plasmídeos pCite-GFP, que codifica, under o promotor T7, a proteína verde fluorescente (GFP), e pCAGGS GFP ^18, que codifica para o mesmo ORF sob o promotor de beta actina de frango ^35, são utilizados como controlos. Neste protocolo, mostram o procedimento para resgatar NDV recombinante a partir do ADNc do NDV lentogénico estirpe Hitchner B1 ⁵ (Figura 4).

Protocol

1. Preparação de células de mamíferos (Figura 4A, Dia 1) Dividir HEp-2 ou células A549 no dia anterior transfeco em placas de 6 poços. Densidade das células deve atingir 80-90% de confluência no dia seguinte. Normalmente, um prato de 100 mm confluentes podem ser divididos em 8 poços (cerca de 1 x 10 6 culas por po). Para cada vírus para ser resgatado, 2-4 poços diferentes devem ser incluídos, bem como dois poços adicionais para os controles pCAGGS-GFP e pCite <s…

Representative Results

Resgate de NDV é um procedimento bem estabelecido, realizada rotineiramente nos laboratórios que têm acesso ao cDNA completo do vírus. No entanto, a natureza estocástica intrínseca do método faz com que seja difícil de alcançar 100% de eficácia de recuperação. Monitorando as primeiras etapas do processo, em especial a eficácia de transfecção e a infecção com o MVA-T7, ajuda a identificar possíveis problemas. Figura 5A mostra transfecção padrão e a eficiência de transfecção / infe…

Discussion

Vários fatores devem ser considerados para alcançar bons resultados ao resgatar NDV. Em primeiro lugar, a construção de cDNA completo para ser usado precisa ser projetado para permitir a incorporação funcional dos novos transgenes / modificações no genoma NDV. Isso significa que, como dito acima, que as seqüências (i) end apropriado gene (GE), intergênica (IG) e de início gene (GS) estão a ser adicionado, se necessário, (ii) não existem sequências GE ou GS putativos para o estrangeiro gene, e (iii) o gen…

Materials

DMEM	CORNING Cellgro	10-013-CV	Any supplier
OptiMEM	GIBCO	31985-070
Lipofectamine 2000 (LPF2000)	Invitrogen	11668-019
35% Bovine Albumin (BA)	Sigma	232-936-2	Any supplier
Trypsin-EDTA	CORNING Cellgro	25-052-CI	Any supplier
Penicillin/Streptomycin (PS) 100x	CORNING Cellgro	30-002-CI	Any supplier
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30070.03	Any supplier
			Cell lines A549 cells (catalogue number CRL-185), HEp-2 cells (catalogue number CRL-185), chicken embryo fibroblasts (catalogue number CRL-12203) and duck embryo fibroblasts (catalogue number CCL-141) are available from the American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). All cell lines are maintained in a 37 °C incubator with 5% CO2 in DMEM 10% FBS, 1% PS. Embryonated chicken eggs Embryonated chicken eggs can be obtained from Charles River Laboratories, Specific Pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Products and Services (Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254, USA) and are maintained at 37 °C. Viability of the embryos is assessed with an egg candler. Eggs are infected when they reach 8-10 days old. Both infection and harvest of the allantoic fluid takes place under sterile conditions. All eggs are autoclaved and discarded following standard laboratory biosafety protocols. Turkey red blood cells (RBC) Turkey RBC can be purchased from Truslow Farms (201 Valley Road, Chestertown, Md 21620, USA)and stored at 4 °C. To prepare RBC for HA assay, wash 5 ml of the commercial stock with 45 ml of PBS 1x in a 50 ml conical tube. Centrifuge for 5 min at 1,000 rpm and carefully discard the supernatant. Dilute pelleted RBC 1:1,000 in PBS 1x for a final 0.5-1.0% concentration. Washed RBC can be stored at 4 °C for several days. Plasmids Plasmid preparations are obtained with any commercially available maxiprep kit following manufacturer's instructions, diluted in ddH20 to a final concentration of 1 μg/μl and stored at -20 °C. DNA concentration and purity are assessed by spectrophotometry at 260 and 280 nm. Preparations with a 260/280 ratio higher than 1.8 are considered of acceptable quality for the rescue. Plasmid DNA quality is also routinely double-checked by agarose gel chromatography. Viruses The described protocol for rescue of the lentogenic NDV strain Hitchner B1 can be performed under biosafety level (BSL) 2 conditions. The Modified Vaccinia Ankara expressing the T7 RNA polymerase (MVA-T7) was described34 and obtained from Dr. Bernard Moss. This virus is growth in confluent monolayers of chicken embryo fibroblasts and titrated in mammalian (A549 or HEp-2) cells. NDV stocks are grown in embryonated chicken eggs and titrated by IFA using polyclonal serum raised against purified virions. All contaminated material should be safely sterilized and disposed according to standard biosafety procedures. Tissue culture media and solutions: DMEM 10% FBS 1% PS: Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and Penicillin/Streptomycin (P/S): 445 ml of DMEM, 50 ml of heat-inactivated FBS, 5 ml of 100x commercial P/S solution. Store at 4 °C. 10x Phosphate buffered saline (PBS): 80 g of NaCl, 2 g of KCl, 11.5 g of Na2HPO4.7H2O, 2 g of KH2PO4. Add ddH2O up to 1 L. Adjust pH to 7.3. Sterilize by autoclave. Store at room temperature. 1x PBS: Dilute 10x PBS 1:10 with ddH2O. Sterilize by autoclave and store at room temperature. 100x Ca/Mg : 1.327 g CaCl2.2H2O, 2.133 g MgCl2•6H2O and add ddH2O up to 100 ml. Autoclave and store at room temperature. 1x PBS/BA/PS: 50 ml of 10x Phosphate buffered saline (PBS) in 437 ml ddH2O. Autoclave and when cooled down to room temperature, add 5 ml 100x Penicillin/Streptomycin 3 ml 35% Bovine and 5 ml of 100x Ca/Mg. Store at 4°C.