Abstract
Adenovirus (AD) utledet vektorer har vært mye brukt for kort eller lang sikt genoverføring, både for genterapi og vaksineprogrammer. På grunn av den hyppige allerede eksisterende immunitet mot klassisk brukes human adenovirus type 5, og canine adenovirus type 2 (CAV2) blitt foreslått som en alternativ vektor for human genoverføring. Den godt karakterisert biology of CAV2, sammen med enkelhet i genetisk manipulering, har store fordeler, særlig for genoverføring inn i det sentrale nervesystemet, eller for indusering av et vidt spekter av beskyttende immunresponser, fra humoral til cellulær immunitet. Dag, CAV2 representerer en av de mest tiltalende ikke-menneskelige adenovirus for anvendelse som en vaksinevektor. Denne protokollen beskriver en enkel metode for å konstruere, produsere og titer rekombinante CAV2 vektorer. Etter kloning av ekspresjonskassett av genet av interesse inn i en shuttle-plasmidet, er det rekombinante genom plasmid oppnådd ved homolog rekombinasjon i E. coli BJ5183 bakteriestamme. Den resulterende genomisk plasmid blir deretter transfektert inn canine nyreceller uttrykker de utfyller CAV2-E1 gener (DK-E1). En viral forsterkning muliggjør produksjon av et stort viral lager, som renses ved ultrasentrifugering gjennom cesiumklorid gradienter og avsaltet ved dialyse. Den resulterende virussuspensjonen har rutinemessig et titer på over 10 10 infeksiøse partikler pr ml og kan direkte administreres in vivo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Jet Prime transfection kit | Polyplus | 114-01 | |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 10567014 | |
| E. coli BJ5183 bacteria | Agilent | 200154 | |
| PD-10 desalting column | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| EmeraldAmp polymerase | Takara | RR320A | |
| Nucleospin plasmid kit | Macherey-Nagel | 740558.250 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.50 | |
| 14 ml tubes, Ultra Clear | Beckman | 344060 |
References
- Kaufmann, J. K., Nettelbeck, D. M. Virus chimeras for gene therapy, vaccination, and oncolysis: adenoviruses and beyond. Trends Mol. Med. 18, 365-376 (2012).
- Curr, Topics Microbiol. Immunol. 343, 195-224 (2010).
- Zak, D. E., et al. Merck Ad5/HIV induces broad innate immune activation that predicts CD8(+) T-cell responses but is attenuated by preexisting Ad5 immunity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3503-3512 (2012).
- Paillard, F. Advantages of non-human adenoviruses versus human adenoviruses. Hum. Gene Ther. 8, 2007-2009 (1997).
- Ackermann, A., Guelzow, T., Staeheli, P., Schneider, U., Heimrich, B. Visualizing viral dissemination in the mouse nervous system, using a green fluorescent protein-expressing Borna disease virus vector. J. Virol. 84, 5438-5442 (2010).
- Bru, T., Salinas, S., Kremer, E. J. An update on canine adenovirus type 2 and its vectors. Viruses. 2, 2134-2153 (2010).
- Bouet-Cararo, C., et al. Canine adenoviruses elicit both humoral and cell-mediated immune responses against rabies following immunisation of sheep. Vaccine. 29, 1304-1310 (2011).
- Soudais, C., Skander, N., Kremer, E. J. Long-term in vivo transduction of neurons throughout the rat CNS using novel helper-dependent CAV-2 vectors. FASEB J. 18, 391-393 (2004).
- Deinhardt, K., et al. Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway. Neuron. 52, 293-305 (2006).
- Soudais, C., Laplace-Builhe, C., Kissa, K., Kremer, E. J. Preferential transduction of neurons by canine adenovirus vectors and their efficient retrograde transport in vivo. FASEB J. 15, 2283-2285 (2001).
- Peltekian, E., Garcia, L., Danos, O. Neurotropism and retrograde axonal transport of a canine adenoviral vector: a tool for targeting key structures undergoing neurodegenerative processes. Mol. Ther. 5, 25-32 (2002).
- Chartier, C., et al. Efficient generation of recombinant adenovirus vectors by homologous recombination in Escherichia coli. J. Virol. 70, 4805-4810 (1996).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Segura, M. M., Puig, M., Monfar, M., Chillon, M. Chromatography purification of canine adenoviral vectors. Human Gene Ther. Methods. 23, 182-197 (2012).
- Segura, M. M., et al. A real-time PCR assay for quantification of canine adenoviral vectors. Journal of virological. 163, 129-136 (2010).
- Fernandes, P., et al. Bioprocess development for canine adenovirus type 2 vectors. Gene Ther. , (2012).
- Rinne, A., Littwitz, C., Bender, K., Kienitz, M. C., Pott, L. Adenovirus-mediated delivery of short hairpin RNA (shRNA) mediates efficient gene silencing in terminally differentiated cardiac myocytes. Methods Mol. Biol. 515, 107-123 (2009).
- Huang, B., Kochanek, S. Adenovirus-mediated silencing of huntingtin expression by shRNA. Hum. Gene Ther. 16, 618-626 (2005).
- Tordo, N., et al. Canine adenovirus based rabies vaccines. Dev. Biol. 131, 467-476 (2008).
