התפוקה microinjections גבוה של zygotes קיפודי הים
Summary
Microinjection הוא טכניקה נפוצה בשימוש כדי לספק בונה DNA, mRNAs, אנטיסנס morpholino או טיפולים אחרים לביציות, עובר, ותאים של מינים שונים.
Abstract
Microinjection לתוך תאים ועוברים הוא טכניקה נפוצה המשמשת ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים. בשיטה זו כמות קטנה של פתרון טיפול הוא נטען לתוך מחט microinjection המשמש להזריק פיזי תאים בודדים משותקים או עוברים. למרות הצורך בהכשרה ראשונית לביצוע הליך זה למסירת תפוקה גבוהה, microinjection מציע יעילות מרבית ומשלוח לשחזור של מגוון רחב של פתרונות לטיפול (כולל תערובות מורכבות של דגימות) לתאים, ביצים או עוברים. יישומים לmicroinjections כוללים משלוח של בונה DNA, mRNAs, חלבונים רקומביננטיים, רווח של פונקציה, ואובדן של חומרים כימיים פונקציה. צבע פלואורסצנטי או colorimetric מתווסף לפתרון המוזרק כדי לאפשר הדמיה מיידית של אספקה יעילה, כמו גם כלי לנורמליזציה אמינה של כמות הפתרון נמסר. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection של z קיפודי הים 100-400ygotes בתוך 10-15 דקות.
Introduction
משלוח טיפול יעיל לשחזור הוא אחד האתגרים מתודולוגיים העיקריים לחוקרים. מספר שיטות הוקמו כדי לספק transiently פתרונות טיפול לביצים, עוברים, ותאים. שיטות אלה כוללות electroporation (המבוסס על הנקבוביות חולפות הניבו בקרום באמצעות פולסים חשמליים קצרים) 1,2, lipofection (משלוח באמצעות השילוב של יפוזומים המכיל טיפול עם הקרום) 1, הפגזת microparticle 1 (DNA הוא זירז במיקרון חלקיקים בגודל מתכת המשמשים לאחר מכן לחדור לתאים במהירות גבוהה), ותמרה (וירוס משמש ככלי מסירה של transgenes). כרגע, microinjection הוא הגישה היחידה שמחזיקה את היתרון של מתן כל פתרון עם יעילות 100% עם ריאגנטים מינימאליים. יתר על כן, פתרון זריקה אחת יכול להיות מורכב מקוקטייל מורכב של טיפולים. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי להצליחly microinject הביצים ועוברים ממספר רב של מינים כמו קיפודי ים 3,4, דגי זברה 5, עכבר 6, צפרדע 7, ובקר 8, כמו גם תאים בודדים בתרבית רקמת 9. זריקות לסטומרים יחיד בשלבי התפתחותיים מאוחרים יותר גם נערכו 10-12.
השיטות הנוכחיות של microinjections מבוססות על שיטת לחץ ההזרקה שהיה בתחילה שתוארה על ידי Hiramoto 10, עם זאת, התקדמות רבה נעשתה לקראת אופטימיזציה של התהליך הזה. טכניקות microinjection מצוינות כבר תיארו במקום אחר 11, וכאן אנו מתארים באחת מהשיטות הספציפיות המשמשת כיום לmicroinject קיפודי ים (purpuratus Strongylocentrotus) ביצים מופרות חדש. במשך יותר ממאה, קיפודי ים היו 15,16 מודל ניסיון יקר ערך. קיפודי ים קשורים באופן הדוק לאבולוציונית chordates (כולל אותנו) וניתוח שלהגנום שלהם גילה כי הם מכילים את כל משפחות גנים גדולות כ17 האנושיים. הם מייצרים מספר גדול של סינכרוני פיתוח עוברים שקופים שניתן להשפיע בקלות. השימוש בקיפוד ים כאורגניזם מודל, קהילת קיפודי הים תרמה להבנתנו את תהליך ההפריה 18-21, תהליכים ביולוגיים תא 22-24, ורשתות גנים רגולטוריים (GRNs) 25-28.
Microinjection לzygotes קיפודי הים דורש מספר שלבים. ראשית, את הביצים צריכה להיות משותקת לפני זריקות (שיפורט להלן). מנות Microinjection הם מצופים סולפט protamine (PS), אשר יוצר משטח חיובי טיעונים שלביצים טעונות השלילי יכולה לדבוק 3. הביצים dejellied על ידי דגירה במי ים חומצי (pH 5.15) עבור 10 דקות, ואחרי שתי שטיפות במי ים טבעיים או מים מלאכותיים ים (pH 8.0). ביצי dejellied הם חתרו בזהירות בקו ישרבאמצע הצלחת מצופה נ.ב. בנוכחות 1 מ"מ 3-aminotriazole (3-AT), אשר נדרש כדי לעכב את הפעילות של ovoperoxidase שמופרש מהגרגרים בקליפת המוח של הביצה כתוצאה מההפריה 29. שלב זה חשוב כדי למנוע התקשות של מעטפת ההפריה וכדי להקל על כניסת מחט microinjection. כחלופה ל1 מ"מ 3-AT, חומצת 10 מ"מ paraminobenzoic (PABA) יכולה לשמש. פתרון ההזרקה הוא נטען לתוך מחט microinjection באמצעות פיפטה קצה microloading מיוחד ורכוב על בעל המצורף לmicromanipulator ויחידת לחץ (איור 1). כל מחט יכולה לשמש כדי microinject zygotes הבודד בניסויים מרובים בימים נפרדים. Microinjection יכול להתבצע ל10-15 דקות, עד zygotes להתקשות. אז zygotes נשטפים עם מי הים ותרבותי ב15 ° C. כאשר העוברים להגיע בקיעת blastula במה, הם משחררים אנזים בקיעה שמעכל רכיבים של ferמעטפת tilization 30 ולאפשר להם להתנתק באופן טבעי מהצלחת המצופה PS. במידת צורך, את העוברים ניתן עדינות מנותקת מהצלחת בעזרת פיפטה פה או פיפטה פסטר בעדינות על ידי נושבת מי ים על העוברים. השיטה המתוארת מאפשרת microinjection יעיל ואמין של 100-400 ביצים מופרות חדש על צלחת אחת, ומספקת שיטת תפוקה גבוהה עבור ניתוחים במורד הזרם.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microinjection הוא טכניקה רבת עוצמה להעברת טיפולים שונים כגון DNA, mRNA, חלבונים רקומביננטיים, אובדן התפקוד ורווח של חומרים כימיים פונקציה, צבעים ושילובים שלהם לביציות, עובר, ותאים של אורגניזמים שונים 1-7. עם זאת, צריכים להיות כל הזמן כמה שיקולים בחשבון בעת תכנון ניסוי mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לסנטיאגו סוארז לקריאה ביקורתית של כתב היד ובטי קאוגיל לסיוע בצילום. אנו מודים גם מבקרים האנונימיים על המשוב הביקורתי שלהם. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המחקר לאוניברסיטת דלאוור.
Materials
| Glass pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. . eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O’Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z. Nonviral gene delivery. Cold Spring Harb. Protoc. , (2011).
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. . Methods in Cell Biology. 25, (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G. Offerings from an Urchin. Dev. Biol. 358, 285-294 (2011).
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article – The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
