Summary
Mikroenjeksiyon yumurtalar, embriyo ve çeşitli türlerin hücrelerine DNA yapıları, mRNA, morfolino antisens oligonükleotidler veya diğer tedaviler sunmak için kullanılan bir tekniktir.
Abstract
Hücre ve embriyo mikro enjeksiyon biyolojik süreçlerin geniş bir çalışma için kullanılan yaygın bir tekniktir. Bu yöntemde, muamele çözeltisi bir miktar fiziksel olarak tek tek hareketsiz hücreler ya da embriyolar enjekte etmek için kullanılan bir mikro-enjeksiyon iğne içine yüklenir. Yüksek verimli teslimat için bu yordamı gerçekleştirmek için ilk eğitim ihtiyacına karşın, mikroenjeksiyon maksimum verimlilik ve hücreler, yumurta veya embriyo içine (numunelerinin kompleks karışımlar dahil) tedavi çözümleri geniş bir yelpazede tekrarlanabilir teslim sunuyor. Mikroenjeksiyon için Uygulamalar DNA konstruktları, mRNA, yeniden birleştirici proteinlerin, fonksiyon kazancı ve reaktiflerin işlev kaybı verilmesini içerir. Floresan boya veya kolorimetrik anlık etkili teslimat görselleştirme hem de verilen ilaç miktarının güvenilir normalizasyonu için bir araç sağlamak için enjekte edilen çözeltiye ilave edilir. Anlatılan yöntem 100-400 deniz kestanesi z mikroenjeksiyon sağlar10-15 dakika içinde ygotes.
Introduction
Verimli ve tekrarlanabilir tedavi teslim araştırmacılar için temel metodolojik zorluklardan biridir. Çeşitli yöntemler geçici yumurta, embriyo ve hücre içine tedavi çözümleri sunmak için kurulmuştur. Bu yöntemler, 1,2, lipofeksiyon (membran ile muamele ihtiva eden lipozomların füzyon yoluyla teslim) 1, mikropartikül bombardımanı 1 (DNA mikron çökeltilir (kısa elektrik darbeleri kullanılarak membran içine bir üreten geçici gözenekler göre) elektroporasyonu ölçekli metal daha sonra yüksek hızda hücrelere nüfuz için kullanılan parçacıklar) ve transdüksiyon (virüs transgenlerin bir iletim aracı olarak kullanılır). Şu anda, mikroenjeksiyon minimal reaktifler ile% 100 verim ile herhangi bir çözüm sunma avantajına sahip tek yaklaşımdır. Ayrıca, tek bir enjeksiyon çözeltisi tedaviler karmaşık bir kokteyli imal edilebilir. Bu teknik, başarılı için kullanılmıştırly örneğin deniz kestanesi 3,4, zebra balığı 5, 6 fare, kurbağa 7, 8 ve sığır hem de doku kültürü 9 tek hücreleri gibi çok sayıda türden yumurta ve embriyolar Microinject. Sonraki gelişim aşamalarında tek blastomerler enjeksiyonları da 10-12 yapılmıştır.
Microinjections güncel yöntem başlangıçta Hiramoto 10 tarafından tarif edilmiştir basınçlı enjeksiyon yöntemine dayalı, ancak büyük ilerleme bu sürecin optimizasyonu doğru yapılmıştır. Mükemmel mikroenjeksiyon teknikleri yerde 11 tarif edilmiştir, ve burada şu anda deniz kestanesi (Strongylocentrotus purpuratus) yeni döllenmiş yumurta Microinject için kullanılan özel yöntemler birini açıklar. Bir yüzyılı aşkın süredir, deniz kestanesi değerli bir deneysel model 15,16 olmuştur. Deniz kestaneleri evrimsel yakından (bize dahil) omurgalılar ve analizi ile ilgiliBu genom, insan 17 gibi tüm ana gen aileleri içerdiğini ortaya koymuştur. Bunlar, senkron olarak kolayca manipüle edilebilir şeffaf embriyo geliştirme, çok sayıda üretir. Bir model organizma olarak deniz kestanesi kullanarak, deniz kestanesi Topluluğumuza döllenme süreci anlayış 18-21, hücre biyolojik süreçler 22-24, ve gen düzenleyici ağlar (GRNs) 25-28 katkıda bulunmuştur.
Deniz kestanesi zigot içine mikroenjeksiyon birkaç adım gerektirir. İlk olarak, yumurta önce (aşağıda tarif edilmiştir) enjeksiyonu için hareketsiz olması gerekir. Mikroenjeksiyon yemekler negatif yüklü yumurta 3 yapışabildiği bir pozitif yüklü yüzey oluşturur protamin sülfat (PS) ile kaplanır. Yumurtalar, doğal veya yapay deniz suyu, deniz suyu (pH 8.0) içinde iki yıkama ve ardından, 10 dakika boyunca asidik deniz suyu içinde inkübe (pH 5.15) ile dejellied edilir. Dejellied yumurta dikkatli bir çizgide küreklidöllenme 29 bir sonucu olarak yumurtanın kortikal granüllerden salgılanan ovoperoxidase aktivitesini inhibe etmek için gerekli olan 1 mM 3-aminotriazolün (3-AT), varlığında, PS kaplı çanak ortasında. Bu adım, döllenme zarfın sertleşmesini önlemek ve mikro-enjeksiyon iğne girişi kolaylaştırmak için önemlidir. 1 mM 3-AT bir alternatif olarak, 10 mM paraminobenzoic asit (PABA) kullanılabilir. Enjeksiyon çözeltisi özel bir microloading pipet kullanarak mikro-enjeksiyon iğne içine yüklendi ve mikromanipülatör ve baskı ünitesine bağlı bir tutacak (Şekil 1) üzerine monte edilir. Her iğne ayrı günlerde çok deneylerde tek zigotların Microinject için kullanılabilir. Zigotlar sertleşmesine kadar Mikroenjeksiyon 10-15 dakika boyunca gerçekleştirilebilir. Zigotlar daha sonra 15 ° C'de deniz suyu ile yıkanır ve kültüre Embriyolar blastula aşamasına kuluçka ulaştıklarında, fer bileşenlerini sindirir kuluçka enzim serbesttilization zarf 30 ve onları doğal PS-kaplı çanak ayırmak için izin verir. Gerekirse, embriyolar hafifçe aşağı embriyoların üzerine deniz suyu üflenerek bir ağız pipet veya Pasteur pipeti kullanılarak tabaktan sökülebilmektedir. Tarif edilen yöntem, alt analizler için yüksek verimli bir yöntem sağlayarak, tek bir tabak üzerinde 100-400 yeni döllenmiş yumurta etkin ve güvenilir bir mikroenjeksiyon sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Protamin sülfatın hazırlanışı (PS) Züccaciye Kaplı
- 50 ml konik bir tüp içinde, deiyonize damıtılmış su (GKD 2 O), 50 ml PS 0.5 g eklenmesi ile protamin sülfat (PS)% 1 çözeltisi hazırlayın. PS tam olarak çözünmesini sağlamak için 1-2 saat boyunca oda sıcaklığında bir tezgah bir karıştırıcı üzerinde yüksek hızda iyice çalkalayın. Bu çözelti, (tam olarak, her kullanım öncesi jel benzeri bir çökeltinin çözünmesi için emin olun) 3, en az 3 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- 60 mm x 15 mm polistren Petri yemekleri bir kol alın ve bankta hem kapaklarını ve dipleri yatıyordu.
- En az 2 dakika boyunca bırakın, yüzeyini kaplamak için yeterli her yemeğin içinde% 1 PS solüsyonu (hem dipleri ve kapaklar kullanılır) dökün. 4 ° C 'de muhafaza edildiğinde, geri kalan çözelti, PS 3 ay içinde bir çok kez tekrar edilebilir
- Yer, damıtılmış su (dH 2 O) ile dolu bir beher içinde yemekler PS-işlemden geçirildi. Için dH 2 O çalıştıran altında beher bırakın en azından10 dk.
- PS kaplı yemekler depolama için hemen veya hava kuru kullanılabilir. Toz birikmesini önlemek için onları kapsar. Bunlar, 1 ay 3 oda sıcaklığında saklanabilir.
2. Deniz Kestanesi gamet elde etmek ve Mikroenjeksiyon için bir PS kaplı çanak üzerinde Yumurta hareketsiz
- Garnetleri 3 (Şekil 2) serbest bırakmak için düz kasların kasılmasını uyardığı sallayarak ya da% 0.5 KCl kadar 1 ml intracoelomic enjeksiyonu ile Spawn deniz kestanesi.
- Hayvan bir erkek ise, beyaz renk sperm ile gösterildiği gibi, 1.5 ml tüp içine bir hayvanın yüzeyinden sperm kuru toplar. Kuru sperm biyolojik fonksiyon kaybı olmadan bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Hayvan nedeniyle yumurta sarısı içeriğine sarı renk ile gösterildiği gibi, bir kadın, deniz suyu ile dolu bir beher içinde gonopores daldırma tarafından gamet toplamak değilse. Yumurta gonopores salınır ve yerçekimi tarafından aşağı yerleşmek olacaktır. </ Li>
- Enkaz böyle 80 mikron naylon örgü filtre kullanılarak hayvan dikenler gibi yumurta Filtre. Yumurta yumurtlama sonra 5-7 saat içinde kullanılması halinde iyi sonuçlar elde edilir.
- Yumurta Dejelly:
- Yumurtanın yaklaşık olarak 1 ml asitli deniz suyu 100 ml hazırlayın. 5,1-5,2, pH 8.0 deniz suyunun pH değerini ayarlamak için, 0.5 M sitrik asit kullanın. Bir pH değerinde çok düşük döllenme azalacak ve bir pH çok yüksek yumurta PS kaplı plakalara takmak için izin vermez.
- Asidik deniz suyuna yumurta (en fazla 1 mi) ilave edin ve yumurta 10 dakika boyunca buz üzerinde yerleşmek için izin verir. Seçenek olarak ise, jöle kat çıkarılması tedavi sırasında yumurta Hafifçe girdapladıktan kolaylaştırılabilir. Bir 3-4 dakika içinde etkili dejelly bu şekilde S. purpuratus yumurta yapabilirsiniz.
- Dikkatle, asitli deniz suyu dökün taze deniz suyu ekleyin ve yumurta buz üzerinde yeniden yerleşmek edelim. Dejellied yumurta gübreleme sorunsuz kadar 6 saat boyunca buz üzerinde saklanabilir
3. Yumurta Row
- GKD 2 O., 10 ml 3-AT 0.84 g çözülerek 3-aminotriazol (3-N, MW = 84,08) içinde 1 M stok çözelti hazırlayın Bu çözüm, en fazla 6 ay için 4 ° C'de saklanabilir.
- Önceden soğutulmuş deniz suyunun 50 ml 1 M stok çözeltisinden 50 ul ekleyerek 3-AT 1 mM'lik çalışma çözeltisi hazırlayın. Buz üzerinde çözüm tutun.
- Yumurta yumuşak kullanım için ağız pipet (Şekil 3) hazırlayın:
- Pipet manuel cam mikropipetler (100 x 1.09 mm OD) çekilir. Açık alev üzerinde iki elinizle mikropipet tutun. Cam erimeye başladığında, dikkatli bir şekilde karşı doğrultularda pipet uçları çekin.
- Parafilm ile sızdırmaz bir mühür, bir plastik boru (ID 1.14 mm) bir pipet çekilmiş bağlayın. Borunun uzunluğu yaklaşık 50-70 cm olmalıdır.
- Için cam boru için tüp ters sonunda steril filtre edilmiş P20 veya P200 ucu takınağız parçası olarak kullanılabilir.
- Ucun çapını ayarlamak için makas ile cam mikropipet ucunu Klip. Optimal çapı hafifçe yumurta (80 um) çapını aşmaktadır.
- Her PS kaplı tabak (taban veya kapak) içine 1 mM 3-AT deniz suyu 4 ml dökün.
- , Ağız pipet al ağzına P20/P200 ucu koymak ve dişleri ile sabitleyin. Yumurta aspire için, ilk olarak deniz suyu, az miktarda aspire. Önce yumurta yükleme için bir sıvı sütunu sahip olarak, tek ağız pipetleme tekniği üzerinde maksimum kontrole sahip olacak.
- Yumurta yakın mikropipet ucu yerleştirin ve yavaşça pipet yumurta birkaç yüzlerce aspire. Cam mikropipet içinde yumurta hapsedin.
- Satır düz bir çizgi ucu hareket ederken yavaşça ağız pipet onları üfleme bir yemeğin üzerine düz bir çizgide yumurta dejellied. Döllenme sorunları nedeniyle p oluşabilir, çünkü sağ enjeksiyonlar önce yumurta Row3-AT deniz suyu 3 maruz rolonged. Ayrıca, PS gibi katyonik yapıştırıcılar yumurta için toksik olabilir, ve gübreleme zarflar kaldırılmış, özellikle uzun süre bu reaktiflerin embriyo maruz için tavsiye edilmez.
- Cam bir pipet kullanarak sıralı yumurta çizgiye yakın yemeğin üzerine bir çizik yapın. Bu çizik gerektiği gibi çözümün akışını ayarlamak için enjeksiyon iğnesi kırmak için önemli olacaktır. Alternatif olarak, çizik çanak 3-AT deniz suyu dökme önce yapılabilir.
4. Deniz Kestanesi Zigotlar Mikroenjeksiyon
- Mikroenjeksiyon istasyonu açmak. Burada FemtoJet enjeksiyon sisteminin kullanımı açıklanmaktadır.
- Bir iğne çektirmenin kullanarak enjeksiyon kılcal damarları çekin. İyi bir iğnenin bir örneği Şekil 4'te gösterilmektedir. Not: RNA enjeksiyonlar için, kılcal kısımların enjeksiyon RNAaz kirlenmesini önlemek için 31 ön-muamele edilmelidir:
- 50 ml konik içine enjeksiyon kılcal damarları yerleştirinborular ve süzüldü, metanol / HCI (9:1) 50 ml. İyice çalkalayın ve 10 saat daha uzun bir gece bekletin.
- Metanol / HCl dökün ve kılcal damarlar aynı tüp içerisinde, süzüldü, metanol ile 2x yıkayın.
- Mümkün olduğu kadar metanol süzün ve metanol içinde tamamen çıkarılmasını sağlamak üzere bir gece boyunca liyofilize kılcal.
- Dikkatli bir iğne yükleme tutucu üzerine iğne kılcal montaj ve Microloader ipuçlarını kullanarak bir örnek çözeltisi <0.5 ul ile yükleyebilirsiniz. Örnek çözeltiler genellikle enjekte edilen malzemenin 3 bağlı olarak,% 20 gliserol ihtiva etmektedir.
- Mikroskop aşamasında (Gözmerceklerinden bakıldığında yumurta dikey olarak aynı hizada olmalıdır) rowed yumurta çanak yerleştirin ve yumurta odaklanın.
- Dikkatlice iğne microinjecting sahibinin üzerine yüklenen iğne montaj ve alanın ortasında mükemmel odaklanmış ipucu var iğnenin konumunu ayarlamak.
- Maksimum basıncı fo uygulamak için düğmeye basınızr iğne temizleme. Çözüm iğne çıkması gerekir. Gerekirse, basıncı ayarlamak için: enjeksiyon basıncı, yaklaşık 1/3, enjeksiyon basıncı dengeleme basıncı ile, 90-360 hPa aralığında olmalıdır.
- Döllenmemiş yumurtanın içine enjekte edilerek çözelti akışını ayarlayın. Bir joystick micromanipulator kullanarak, döllenmemiş yumurta enjeksiyon iğne ucu doğrudan. , Iğne girişini kolaylaştıracak böyle bir tornavida gibi sert bir cisimle aşamasında nazik dokunarak hafif titriyordu oluşturmak için. Yumurta içinde şekillendirme bir bolus enjeksiyon (Şekil 5) görülmelidir.
- Enjeksiyon iri hap şeklinde görünür değilse, hafif, yumurtaların yukarıdaki iğne ucu yükseltmek yemeğin üzerinde çizik bulmak ve alanın ortasında yer şekilde ayarlamak. Yavaşça bir iğne ucu kırmak için karalama işaretine iğne ucu dokunun. Enjeksiyon bolus t 1/5 aşmamasını sağlamak için enjeksiyon ve tazminat basınçları ayarlayınyumurta (1-2 pm) ve o çapı.
- Enjeksiyonu bolus kalibre edildikten sonra, sulandırılmış sperm (1:1,000) veya sperm 1-2 ul ekleyerek yumurtaları döller. Yumurta satır yerinden oynatmamaya önlemek için dikkatli bir şekilde iyice karıştırın.
- Fertilizasyon zarf (Şekil 5) görünür hale gelir hemen sonra enjeksiyonları başlayın. Sahne denetleyicisi kullanarak sıralı yumurta hattı boyunca hareket ve joystick micromanipulator tarafından kontrol iğne ile alay ederek mümkün olduğunca çok sayıda zigot enjekte.
- 10-15 dakika sonra, yeni döllenmiş yumurta sertleştirilmiş olacaktır ve herhangi bir daha fazla enjekte edilebilir olamaz. Aşamasından çanak çıkarın ve dikkatli bir plastik Pasteur pipet kullanarak 3-AT deniz suyunda sperm dışarı aspire.
- Zigot kuru izin vermeyin. Çabuk çanak kapağı taze önceden soğutulmuş deniz suyu ekleyin. 15 ° C de inkübe embriyolar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP ve MCherry raportör transkribe yapıları ve yeni döllenmiş yumurtalar içine mikro-enjekte in vitro idi. Embriyolar (Blastula aşamasına kadar), 24 saat boyunca 15 ° C'de inkübe edildi ve Zeiss Observer Z1 mikroskop kullanılarak görüntülendi. Raportör yapılan enjeksiyon herhangi gelişim kusurları (Şekil 6) yol vermedi. Floresan sinyallerin ölçümü için, görüntü alma maksimum floresan piksel (Şekil 6D-F) yakalamak için düşük büyütme (100X) gerçekleştirildi. Flüoresan sinyalleri Axiovision 4.8.2.0 kullanılarak ölçüldü. 100-200 blastulae nüfus içinde flüoresan sinyallerin yoğunluğu için standart hatalar (veriler gösterilmemiştir),% 1.5 'geçmemiştir.
Şekil 1. Mikroenjeksiyon kurulumu. (A) PS kaplı dihareketsiz yumurta ile sh (B) ters bir mikroskop sahnede yer almaktadır. Mikroenjeksiyon iğne (C) 'a (D) basınç birimine bağlı olan bir iğne tutucu bağlanmıştır. X-, y-ve z-boyutlu hareket (E) mikromanipülatör ya da (F) kaba manipülatör kullanılarak yöneliktir. (G) kağıt havlu ile sarılı bir tornavida yeni döllenmiş yumurtanın içine iğne girişini kolaylaştırmak için hafif titriyordu ikna etmek için nazikçe mikroskop sahne dokunun kullanılır.
Şekil 2. Deniz kestanesi yumurtlama. (A) Deniz kestanesi% 0.5 KCl intracoelomic enjeksiyonu ile döken uyarılmaktadır. İğne hayvanın, hayvanın tek yumuşak kısmının ağzını çevreleyen peristomial zara sayı.(B) Bayan deniz kestanesi sarı yumurtaları toplamak için plastik bir şişeye deniz suyu dalmış kendi gonapores ile yerleştirilir. (C) Beyaz sperm erkek deniz kestanesi gonapores salınır.
Şekil 3,. . (A) Cam mikropipet iğne, (B), plastik boru, ve (C) steril filtrelenmiş P20 veya P200 ipucu: Ağız pipet Bir ağız pipet üç bölümden oluşmaktadır. Cam mikropipet P20 veya P200 ağız parçasına bağlı olan plastik boru içine sokulur.
Şekil 4. Mikroenjeksiyon iğnesi. (A) mikroenjeksiyon iğne pul olduğunuBelirli bir ayar ile bir iğne çektirmenin kullanarak açtı. İğne çektirmenin ayar ampirik olarak tespit edilmesi gerekmektedir. Bir Narishege PC-10 iğne çektirmenin kullanarak, ısı ayarı 2 için 1 ayarı ısı 72.8 ° C kullanın ve 83.7 ° C. Plaka üzerinde çizik kullanımıyla çok çözelti akışını kolaylaştırmak için iğne ucu bölünürler. (B) iyi iğne ucundaki 5 um omuz 50 um arasında bir genişliğe 500-600 um arasında bir uzunluğa sahip olmalıdır.
Şekil 5,. Yeni döllenmiş deniz kestanesi yumurta enjeksiyonu. Dejellied yumurta PS kaplı çanak ve döllenmiş rowed edildi. (Üstten alta doğru) Zigotların hattı boyunca mikroskop sahne hareket ederken yeni döllenmiş yumurta tek tek enjekte edilir. (A) bolus enjeksiyon açıkça yeni döllenmiş içine şekillendirme görülüriğnenin ucunda yumurta. (B) Şeffaf döllenme zarf döllenme sonucunda oluşur. (C) Sperm arka planda küçük siyah noktalar görünür. Ölçek çubuğu 50 mm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Şekil 6,. Gelişimsel ya da morfolojik kusurlar olmadan blastulae haline mikro-enjekte zigot. Yeni döllenmiş yumurta onları açıkça (oklarla gösterilmiştir) enjeksiyon yapılmamış embriyolardan ayırdedilmesine olanak sağlayan flüoresan işaretçileri enjekte edilmiştir. (AC) Embriyolar 400X büyütme görüntülendi. (DF) Embriyolar güvenilir bir ölçümü için yayılan floresan sinyalleri en yakalamak için 100X büyütme ile görüntülü. Sonra 24 saat post gübreleme, blastulae toplanmış ve 1 x tuzlu su yıkaması ve ardından yüzme embriyolar 3, hareketsiz hale getirmek için 2 dakika süreyle 2 x deniz suyu ile tedavi edildi. Görüntüler Zeiss Gözlemci Z1 mikroskop ve Axiocam monochromic kamera ile elde edildi. (A, D) blastulae içinde DIC görüntüler. (B, E) in vitro ile enjekte edilen embriyoların Bindirme görüntüleri floresan ve DIC kanallarında mCherry transkripsiyonu. (C, F) in vitro enjekte edilmiş embriyoların Bindirme görüntüleri floresans ve DIC kanallarda GFP transkripsiyonu. Ölçek çubuğu 50 mm. resmi büyütmek için buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mikroenjeksiyon DNA, mRNA, yeniden birleştirici proteinlerin, fonksiyon kaybı ve yumurta, embriyo ve çeşitli organizmaların 1-7 hücrelerine fonksiyonu reaktifler, boyalar ve bunların kombinasyonları gibi çeşitli tedaviler kazancı sağlanması için güçlü bir tekniktir. Mikroenjeksiyon deney tasarımı Ancak, bazı noktalar akılda tutulmalıdır.
Bu teslim tedavi ve enjeksiyon hacminin çözünürlüğünü dikkate almak çok önemlidir. Microinjected çözüm bile hafif bir çökelti oluşturmak eğilimi varsa, microinjecting iğne tıkanmış olacaktır. Genel olarak, herhangi bir çökelti çözeltisi 3 kaldırılır emin olmak için iğne içine yüklenmeden önce en fazla 15 dakika boyunca santrifüj çözüm önerilir. Diğer bir yaklaşım Millipore kolonlanyla yoluyla çözümü geçmektir. Bu tıkanmasını önlemek için mümkün değilse, bu yeniden kırarak ucu yumuşak tarafından iğne tıkanıklığı mümkün olabilirancak bu uç çok geniş olursa, çözeltinin akışını kontrol etmek zor olur. Enjekte edilen çözelti büyük miktarda embriyo için toksik olabilir, dahası, geniş uç ayrı embriyoların içine enjekte solüsyon hacımlarının arasında daha fazla varyasyon getirmektedir. Bu yeni döllenmiş yumurta enjekte birimin miktarı ayarlanır olması da önemlidir. Enjekte edilen hacim yağ içine solüsyon enjekte ardından çeşitli ayarları iğneler çekerek kalibre edilebilir. Bu damlacık 32 çapını (ve dolayısıyla hacim) ölçülmesi için izin verir. Şekil 5'te gösterildiği gibi, yeni döllenmiş yumurta enjeksiyon çözeltisi, kabul edilebilir bir miktarda zigotun 1/5 çapını aşmamalıdır bulabilirsiniz.
Ana tavsiyem hızlı çalışması için sağ enjeksiyondan önce iğneyi yüklemek için, ve sık sık yılında çıkışına maksimum kullanılabilir basınç uygulamasını tetikleyen enjektör temizleme düğmesi işlevini kullanmak içinEngellenen bir iğne dışarı floş için.
Daha önce enjekte yumurtadan sperm ve moloz iğnenin ucu sadık zaman bazen iğne, dışarıdan tıkayabilir. Bu durumda, bu iğne yukarı enjekte çanak 3-AT sudan tüm yol yükseltmek için yararlıdır. Genellikle, sıvı-hava ara neden olduğu gerilim artıkları ayırmak için yeterli değildir. Alternatif olarak, yavaşça enjeksiyon plaka üzerinde çizilmeye karşı enjeksiyon iğnesi fırçalama da yardımcı olabilir. Aşırı durumda, damlatma ıslak Kimwipe iğne ucu temizlemek mümkündür. Ancak, bu tür silme çok dikkatli ve pratik gerektirir.
Bu tür 10,000 MA Texas Red lisin gibi floresan boyalar (2 mg / ml) dekstran şarj tespit edilir ve enjekte edilen çözelti güvenilir normalleştirilmesi için kullanılabilecek kuvvetli bir sinyal üretir. MRNA enjekte edilecek olduğunda, bunun içinde mRNA ile birlikte ya GFP mCherry mRNA ile birlikte enjekte etmek önerilirmRNA hiçbir bozulma meydana sağlamak zasyonu. Bu durumda, floresan sinyalinin görselleştirme mCherry veya GFP çevrilmesinden bağlıdır. Boyalar ya da floresan konstruktların kullanımı mümkün değilse, bu çanak tüm yeni döllenmiş yumurta enjekte edilir olduğundan emin olmak için her bir tabak üzerinde yumurta küçük bir miktar satır önerilir.
Sonuç olarak, mikroenjeksiyon genetik, moleküler, hücresel ve gelişimsel biyoloji araştırma için değerli bir araçtır. Bu tekniği kullanarak, deniz kestanesi topluluk gibi hücre kaderinin şartname, gen fonksiyonu, gen düzenlemesi ve biyokimyasal yollar yatan embriyonik gelişimi gibi 16 hücre ve gelişim biyolojisi anlayışımıza önemli katkılarda bulunmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını ya da diğer ilgi çatışmalarını beyan.
Acknowledgments
Biz fotoğraf yardım için el yazması ve Betty Cowgill eleştirel okuma Santiago Suarez teşekkür ederim. Biz de onların kritik geribildirim için anonim yorumcular teşekkür ederim. Bu çalışma University of Delaware Araştırma Fonu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14673-043 | |
| Inverted microscope Axiovert 40 °C | Zeiss | 4109431007990000 | Injection microscope |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242 956.003 | Load injection solution |
| Nylon filter mesh 80 μm | Amazon.com | 03-80-37 | Filter eggs to get rid of debris |
| P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips | Fisher Scientific | 02707432 or 02707430 | Part of a mouth pipette |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13 374 12 | Part of a mouth pipette |
| Polyethylene tubing | Intramedic | PE-160 | Part of a mouth pipette |
| Protamine sulfate | MP Biomedicals, LLC | 194729 | Attach dejellied eggs to injection dishes |
| Sea urchins S. purpuratus | Pt. Loma Marine Invertebrate Lab | N/A | |
| Sea water | any pet store | Instant Ocean | |
| Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | Injection dishes |
| Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1 | Narishige | 9124 | Manipulate injection needle |
| Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND | Narishige | 9212 | Manipulate injection needle |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | |
| Vertical needle puller | Narishige | PC-10 | Pull injection needles |
References
- Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochem. Biophys.Res. Commun. 230, 376-380 (1997).
- Peng, H., Wu, Y. Y., Zhang, Y. Efficient Delivery of DNA and Morpholinos into Mouse Preimplantation Embryos by Electroporation. Plos One. 7, 13 (2012).
- Ettensohn, C. A., Wray, G. A., Wessel, G. M. eds. Development of sea urchins, ascidians, and other invertebrate deuterostomes: experimental approaches. 74, Elsevier Academic Press. (2004).
- Franks, R. R., Houghevans, B. R., Britten, R. J., Davidson, E. H. Direct introduction of cloned DNA into the sea urchin zygote nucleus, and fate of injected DNA. Development. 102, 287-299 (1988).
- Kinsey, W. H. Analysis of signaling pathways in zebrafish development by microinjection. Methods Mol. Biol. 518, 67-76 (2009).
- Kola, I., Sumarsono, S. H. Microinjection of in vitro transcribed RNA and antisense oligonucleotides in mouse oocytes and early embryos to study the gain- and loss-of-function of genes. Mol. Biotechnol. 6, 191-199 (1996).
- Mishina, T., Fuchimukai, K., Igarashi, K., Tashiro, K., Shiokawa, K. Modification of secondary head-forming activity of microinjected a dagger beta-catenin mRNA by co-injected spermine and spermidine in Xenopus early embryos. Amino Acids. 42, 791-801 (2012).
- O'Meara, C. M., et al. Gene silencing in bovine zygotes: siRNA transfection versus microinjection. Reprod. Fertil. Dev. 23, 534-543 (2011).
- Dean, D. A., Gasiorowski, J. Z.
- Hiramoto, Y. Cell division without mitotic apparatus in sea urchin eggs. Exp. Cell Res. 11, 630-636 (1956).
- Wilson, L. Methods in Cell Biology. 25, Elsevier. (1982).
- Gross, J. M., McClay, D. R. The role of Brachyury (T) during gastrulation movements in the sea urchin Lytechinus variegatus. Dev. Biol. 239, 132-147 (2001).
- Yajima M, W. G. Autonomy in specification of primordial germ cells and their passive translocation in the sea urchin. Development. 139, 3786-3794 (2012).
- Duboc, V., et al. Nodal and BMP2/4 pattern the mesoderm and endoderm during development of the sea urchin embryo. Development. 137, 223-235 (2010).
- Ernst, S. G.
- McClay, D. R. Evolutionary crossroads in developmental biology: sea urchins. Development. 138, 2639-2648 (2011).
- Sodergren, E., et al. Research article - The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
- Roux, M. M., et al. A functional genomic and proteomic perspective of sea urchin calcium signaling and egg activation. Dev. Biol. 300, 416-433 (2006).
- Turner, P. R., Sheetz, M. P., Jaffe, L. A. Fertilization increases the polyphosphoinositide content of sea urchin eggs. Nature. 310, 414-415 (1984).
- Voronina, E., Marzluff, W. F., Wessel, G. M. Cyclin B synthesis is required for sea urchin oocyte maturation. Dev. Biol. 256, 258-275 (2003).
- Wong, J. L., Wessel, G. M. Extracellular matrix modifications at fertilization: regulation of dityrosine crosslinking by transamidation. Development. 136, 1835-1847 (2009).
- Shuster, C. B., Burgess, D. R. Transitions regulating the timing of cytokinesis in embryonic cells. Curr. Biol. 12, 854-858 (2002).
- Morris, R. L., et al. Analysis of cytoskeletal and motility proteins in the sea urchin genome assembly. Dev. Biol. 300, 219-237 (2006).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of Cell Geometry on Division-Plane Positioning. Cell. 144, 414-426 (2011).
- Davidson, E. H., et al. A genomic regulatory network for development. Science. 295, 1669-1678 (2002).
- Oliveri, P., Tu, Q., Davidson, E. H. Global regulatory logic for specification of an embryonic cell lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5955-5962 (2008).
- Peter, I. S., Davidson, E. H. A gene regulatory network controlling the embryonic specification of endoderm. Nature. 474, (2011).
- Nam, J. M., Dong, P., Tarpine, R., Istrail, S., Davidson, E. H. Functional cis-regulatory genomics for systems biology. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 3930-3935 (2010).
- Showman, R. M., Foerder, C. A. Removal of the fertilization membrane of sea-urchin embryos employing aminotriazole. Exp. Cell Res. 120, 253-255 (1979).
- Lepage, T., Sardet, C., Gache, C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea-urchin embryo. Dev. Biol. 150, 23-32 (1992).
- Jaffe, L. A., Terasaki, M. Quantitative microinjection of oocytes, eggs, and embryos. Development of Sea Urchins, Ascidians, and Other Invertebrate Deuterostomes: Experimental Approaches. 74, 219-242 (2004).
