High Throughput microinjeções de ouriço do mar zigotos

Summary

A microinjecção é uma técnica comum usada para fornecer estruturas de ADN, ARNm, oligonucleidos morfolino anti-sentido ou outros tratamentos em ovos, embriões, e as células de várias espécies.

Abstract

Microinjecção de células e de embriões é uma técnica comum que é usado para o estudo de uma ampla gama de processos biológicos. Neste método, uma pequena quantidade de solução de tratamento é colocado numa agulha de microinjecção que é utilizado para injectar células imobilizadas fisicamente ou embriões individuais. Apesar da necessidade de formação inicial para realizar esse procedimento para entrega de alto rendimento, a microinjeção oferece o máximo de eficiência e entrega reprodutível de uma ampla variedade de soluções de tratamento (incluindo misturas complexas de amostras) em células, ovos ou embriões. Aplicações para microinjeções incluem entrega de construções de DNA, mRNAs, proteínas recombinantes, ganho de função e perda de reagentes de função. Corante fluorescente ou colorimétrica é adicionado à solução injectada para permitir a visualização instantânea de entrega eficiente, bem como uma ferramenta para a normalização fiável da quantidade de solução apresentadas. O método descrito permite microinjeção de 100-400 mar ouriço-do-zygotes dentro de 10-15 minutos.

Introduction

Entrega eficiente e reprodutível tratamento é um dos principais desafios metodológicos para os investigadores. Vários métodos têm sido estabelecidos para entregar transitoriamente soluções de tratamento para os ovos, embriões e células. Estes métodos incluem electroporação (com base em um gerando poros transientes na membrana utilizando impulsos eléctricos curtos) ^1,2, lipofecção (entrega através da fusão de lipossomas contendo de tratamento com a membrana) ^1, bombardeamento com micropartículas ¹ (ADN é precipitado na mícron partículas de dimensão de metal que são, então, utilizadas para penetrar as células a alta velocidade), e transdução (vírus é utilizado como um veículo de entrega de transgenes). No momento, a microinjecção é a única abordagem que tem a vantagem de fornecer uma solução com uma eficiência de 100%, com o mínimo de reagentes. Além disso, uma única solução para injecção pode ser composto por um complexo coquetel de tratamentos. Esta técnica tem sido utilizada para o sucessoly microinject os ovos e embriões de várias espécies, como ouriços do mar, ^3,4 zebra peixe ^{5, 6} rato, sapo ⁷ e ^{8 de} gado, bem como as células individuais na cultura de tecidos ^9. Blastômeros Solteiro injeções em fases posteriores de desenvolvimento também foram realizados ^10-12.

Os métodos atuais de microinjeções são baseados no método de pressão de injeção, que foi inicialmente descrita por Hiramoto ^10, no entanto, grandes progressos foram feitos no sentido de otimização deste processo. Técnicas de microinjeção Excelentes foram descritos em outro ^11, e aqui nós descrevemos um dos métodos específicos que atualmente é usado para microinject ouriço do mar (Strongylocentrotus purpuratus) ovos recém-fertilizados. Por mais de um século, ouriços do mar têm sido um valioso modelo experimental ^15,16. Ouriços do mar são evolutivamente intimamente relacionado com cordados (incluindo nós) e análise deseu genoma revelou que contêm todas as principais famílias de genes como o ¹⁷ humana. Eles produzem um grande número de embriões em desenvolvimento sincronicamente transparentes que podem ser facilmente manipuladas. Usando ouriço do mar como um organismo modelo, a comunidade ouriço do mar tem contribuído para o nosso entendimento do processo de fertilização ^18-21, processos biológicos celulares ^22-24, e as redes de regulação gênicas (GRNs) ^25-28.

Microinjeção em zigotos ouriço-do-mar requer várias etapas. Em primeiro lugar, os ovos devem ser imobilizada antes das injecções (descrito abaixo). Pratos de micro-injecção são revestidas com sulfato de protamina (PS), que cria uma superfície positivamente carregada a que os ovos carregados negativamente podem aderir ^3. Os ovos são dejellied por incubação em água do mar acidificada (pH 5,15) durante 10 min, seguido por duas lavagens em água do mar natural ou de água do mar artificial (pH 8,0). Os ovos são cuidadosamente dejellied remou em uma linha retano meio do prato de PS-revestido na presença de 1 mM de 3-aminotriazole (3-AT), que é necessária para inibir a actividade da ovoperoxidase, que é segregada a partir dos grânulos corticais do ovo como um resultado de fertilização ^29. Esta etapa é importante para prevenir o endurecimento do invólucro de fertilização e de facilitar a entrada da agulha de microinjecção. Como uma alternativa para 1 mM de 3-AT, 10 mM de ácido paraminobenzoic (PABA) pode ser utilizado. A solução injectável é carregado para uma agulha de microinjecção utilizando ponta microloading pipeta especializado e montado sobre um suporte ligado a micromanipulador e da unidade de pressão (Figura 1). Cada agulha pode ser usado para microinject zigotos individuais em várias experiências em dias separados. Microinjecção pode ser realizada durante 10-15 minutos, até os zigotos endurecer. Os zigotos foram então lavadas com a água do mar e cultivadas a 15 ° C. Quando os embriões atingem incubação blastula fase, eles liberam enzimas incubação que digere componentes da fertilization envelope ³⁰ e permitir-lhes retirar naturalmente a partir do prato de PS-revestido. Se necessário, os embriões podem ser suavemente separado do prato usando uma pipeta de boca ou pipeta Pasteur soprando suavemente por água do mar para os embriões. O método descrito permite a microinjecção eficiente e fiável de 100-400 ovos recentemente fertilizados num prato único, fornecendo um método de alto rendimento para a análise a jusante.

Protocol

1. Preparação de sulfato de protamina (PS) Pratos revestidos Preparar a solução de 1% de sulfato de protamina (PS) por adição de 0,5 g de PS em 50 ml de água destilada e desionizada (ddH2O) em um tubo de 50 ml. Agitar bem a alta velocidade num misturador de bancada à temperatura ambiente durante 1-2 horas para garantir a dissolução completa do PS. Esta solução pode ser guardada a 4 ° C durante pelo menos 3 meses (certifique-se dissolver completamente precipitado do tipo gel, antes de c…

Representative Results

GFP e mCherry construções repórter foi transcrito in vitro e microinjectado em ovos recentemente fertilizados. Os embriões foram incubados a 15 ° C durante 24 horas (até a fase de blástula) e fotografada usando Zeiss Observador Z1 microscópio. Injecção de construções repórter não conduziu a quaisquer defeitos do desenvolvimento (Figura 6). Para a quantificação dos sinais fluorescentes, a aquisição de imagem foi realizada a baixa ampliação (100X) para capturar maximamente pix…

Discussion

A microinjecção é uma técnica poderosa para entregar vários tratamentos, tais como o ADN, ARNm, proteínas recombinantes, perda de função e ganho de reagentes funcionais, corantes e as suas combinações em ovos, embriões, e as células de vários organismos ^1-7. No entanto, várias considerações devem ser mantidos em mente ao projetar um experimento de microinjeção.

É criticamente importante considerar a solubilidade do tratamento entregue e o volume de injecção. S…

Materials

Glass pasteur pipettes	VWR	14673-043
Inverted microscope Axiovert 40C	Zeiss	4109431007990000	Injection microscope
Microloader tips	Eppendorf	5242 956.003	Load injection solution
Nylon filter mesh 80 μm	Amazon.com	03-80-37	Filter eggs to get rid of debris
P20 or P200 Aerosol Barrier Pipette Tips	Fisher Scientific	02707432 or 02707430	Part of a mouth pipette
Parafilm	Fisher Scientific	13 374 12	Part of a mouth pipette
Polyethylene tubing	Intramedic	PE-160	Part of a mouth pipette
Protamine sulfate	MP Biomedicals, LLC	194729	Attach dejellied eggs to injection dishes
Sea urchins S. purpuratus	Pt. Loma Marine Invertebrate Lab	N/A
Sea water	any pet store	Instant Ocean
Sterile 60 mm x 15 mm Polystyrene Petri Dish	Fisher Scientific	0875713A	Injection dishes
Three-Axis Coarse Positioning Micromanipulator MMN-1	Narishige	9124	Manipulate injection needle
Three-Axis Joystick Type Oil Hydraulic Fine Micromanipulator MMO-202ND	Narishige	9212	Manipulate injection needle
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM
Vertical needle puller	Narishige	PC-10	Pull injection needles