Summary
回声心动图通常用于非侵入性地描述和量化心脏结构和功能的变化。我们描述了一种基于超声波的成像算法，该算法提供了心肌微观结构的增强替代测量，并且可以使用开放访问图像分析软件执行。
Abstract
心电图是一种广泛访问的成像方式，通常用于非侵入性地描述和量化心脏结构和功能的变化。对心脏组织的超声波评估可以包括对特定感兴趣区域内的背散射信号强度的分析。以前建立的技术主要依赖于反散射信号强性的集成值或平均值，这可能容易受到基于周期变化的算法的低帧速率和算法时间延迟的别名数据的变异性的影响。在此，我们描述了一种基于超声波的成像算法，该算法从以前的方法扩展到单个图像帧，并说明从给定心肌样本中提取的信号强度值的完整分布。当应用于具有代表性的鼠标和人类成像数据时，该算法区分有或不暴露于慢性后置阻力的受试者。该算法提供了心肌微观结构的增强替代测量，可使用开放访问图像分析软件执行。
Introduction
心电图是一种广泛访问的成像方式，通常用于非侵入性地描述和量化心脏结构和功能的变化。对心脏组织的超声波评估可以包括在特定时间点以及心脏周期过程中分析特定感兴趣区域内的背散射信号强度。先前的研究表明，测得声像信号强度可以识别心肌纤维混乱、可行与不可行心肌组织以及间质纤维化1-3的基本存在。我们称心肌"微结构"为组织结构，可以使用声学分析进行特征，超越毛额和形态的线性测量。因此，对声像信号强度的分析用于评估心肌组织在肥大和扩张性心肌病4，5，慢性冠状动脉疾病6，7和高血压心脏病8，9的设置的微结构变化。然而，先前建立的技术主要依赖于反散射信号强性的综合值或平均值，这可能容易受到随机噪声5、低帧速率10的别名数据以及基于周期变异11的算法的时间延迟的影响。
本文介绍了使用超声波图像分析算法的方法，该算法从以前的方法延伸至过去：此算法侧重于用于图像分析的单个末端舒张框架，并说明从给定心肌样本中提取的信号强度值的完整分布。该算法使用围网作为帧内参考12，13，可重复量化声学信号强度分布的变化，并提供心肌微观结构的增强替代测量。在分步协议中，我们描述了在选定的感兴趣区域内准备用于使用的图像、取样感兴趣区域和处理数据的方法。我们还展示了应用该算法从小鼠和人类那里获得的回声心电图图像的代表性结果，这些图像可对左心室的后负荷应力进行可变暴露。
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Protocol
1. 分析图像的准备
- 在半轴视图中获取穆林或人类超心电图 B 模式图像。根据通常的做法，调整时间收益补偿设置和传输焦点的放置，以优化 LV 和其他心脏结构在参数视图中的可视化。确保以 DICOM 文件格式保存所有图像。标准化的图像视图将推理左心室壁置于框架底部。框架必须显示整个左心室心肌和心肌。分辨率必须足够高，以划定左心室的腹腔边界、心肌壁和心内壁。丢弃具有过量辍学或图像神器的图像。
- 将图像文件导入图像J软件平台v1.46作为DICOM文件进行分析。将文件转换为 8 位图像文件。
- 滚动浏览心脏周期的连续帧，直到达到适当的质量末期舒张框架。或者，在回声心动图查看程序中选择末端舒张帧，然后导入高分辨率.jpg文件格式，供 ImageJ 使用。使用心电图跟踪的 R 波识别最接近末端硅胶的帧，然后识别捕获 LV 的最大内部维度的单个最佳帧。将此单帧视为末端舒张框架。
- 建议用户在选择感兴趣的区域时，不要盲目使用主题标识。
2. 投资回报率抽样
- 围网参考选择。在选择感兴趣的围产区 （ROI） 时，旨在捕捉围膜组织的异质性。请注意，图像亮度和对比度可根据需要根据需要进行投资回报率选择调整，但不会对分析结果产生任何影响。
- 使用 ImageJ 的矩形绘图工具，选择长度接近基底推理围墙中间三分之一的矩形。
- 调整矩形投资回报率，使用投资回报率大小工具跨越环形的宽度。
- 使用 ImageJ 的旋转工具将投资回报率旋转到围网区域内。
- 对围网投资回报率的各个角落进行必要的调整。捕获位于心周壁中间三分之一内的最终心周区域，包括围墙的宽度，而不会延伸到心肌或心脏外区域。旨在为给定研究中提出的所有测量捕获相同的相对位置和总围网面积百分比。
- 通过 ImageJ 分析工具将算法应用到选择中（参见第 3 节）。
- 心肌选择。再次，旨在捕捉心肌组织在基底推断心肌壁中间三分之一内的异质性。请注意，图像亮度和对比度可根据需要根据需要进行投资回报率选择调整，但不会对分析结果产生任何影响。
- 选择横跨心肌壁宽度的矩形，不包括心内膜和心内膜。确保心肌选择位于腹肌选择的旁边，并处于相同的角度。不包括选择区域内的乳骨肌肉区域。
- 旋转心肌投资回报率，使其与心肌选择平行。
- 对心肌投资回报率的各个角落进行必要的调整。隔离位于心肌壁中间三分之一的最终心肌区域，并捕获墙的宽度，而不会延伸到心腹或内线区域。
- 通过 ImageJ 宏将算法应用于选择。
3. 数据分析和处理
- 安装名为"获取希图值.txt"的图像J宏。
- 使用 ImageJ 直方图分析工具预览投资回报率内信号强度值的分布（执行此步骤进行心周选择和心肌选择）。
- 使用 ImageJ 宏记录这些信号密度值用于投资回报率（执行此步骤进行心周选择和心肌选择）。
- 将强度值从 0（最暗）分配到 255（最亮）单位到选择中的每个像素。
- 按增加强度的顺序分层排列强度值，以产生信号强度的分布。
- 选择并报告分布的以下百分位数值：20百分位、50百分位（中位数）和 80百分位数。
- 使用心周参考使心肌梗塞正常化。
- 通过将心肌百分位数的强度值除以强度12的相应心周百分位数值，或从强度13的心肌百分位数值中减去心肌百分位数值来正常化。
- 报告四种分析方法的值：使第 20 个百分位、50 个百分位（中位数）和 80 个百分位数的心肌到心电值正常化。
4. 量化周期性变异性
- 通过 DICOM 文件的连续帧将算法应用于心肌选择，在心脏循环中移动。比较帧之间的强度分布差异，并注意末收缩和末端舒张帧。
上述所有图像分析均在以前以 DICOM 格式获取和数字存储的非侵入性超声心动图图像上离线进行。所有研究协议均由布里格姆和妇女机构审查委员会和哈佛医学区常设机构动物护理和使用委员会批准。
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Representative Results
信号强度分析主要包括4个主要步骤（图1），包括：1）图像选择和格式，2）采样投资回报率和参考区域，3）算法应用，4）处理最终值，以产生心肌与心肌强度比。投资回报率的选择和大小标准化，以限制互用器以及内部使用者变异性（图 2）。每个投资回报率的定位也标准化，针对每个主体的解剖结构，以限制主体间和主体内部的变异性。
作为心肌密度的衡量标准，该算法预计将揭示整个心脏周期中信号强度的变化，与音体心肌密度的预期增长相对应。如 图3所示，信号强度的百分位数值较高，突出了有或没有7周暴露在后负荷阻力下的小鼠的周期性变异性（即 与接受虚假手术的车辆控制小鼠相比，小鼠经历了上升主动脉收缩）。
从单个末端舒张框架（图4）的分析中，与具有代表性的对应体（对照组）相比，小鼠和暴露于慢性后荷应激（病例）的老鼠和人类受试者也注意到了显著差异。信号强度的范围和强度因情况和控件而异。从循环变异性分析中可以看出，每个信号强度分布中80与50个百分位值相比，表明个案和控制之间的信号强度存在较大的相对差异。
此处介绍的算法以心肌与心周率的形式提供输出信号强度，其中心周值作为帧内参考值（图 5）。心肌与心周信号强度比是根据对从代表性控制和后载应力案例获得的图像的单帧分析确定的。与上述结果相一致，心肌与心电图比为 80百分位信号强度值提供了区分控件和案例的最大能力。根据我们的图像分析结果，心肌微观结构的预期差异与控制心肌组织组织学和病例小鼠在假手术或主动脉带手术后7周的发现一致（图6）。
图1。 单个图像的工作流过程。 该过程包括四个主要步骤，在比较受试者或量化周期性变异性时可能会重复。
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图2。感兴趣区域 （ROI） 采样技术。 图像分析算法标准化，适用于小鼠（A）和人类（B）。分别显示具有代表性的鼠标和人类图像的心肌和心周选择。
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图3。在整个心脏周期中，声像信号强度的变化。该算法应用于从具有代表性的控制鼠标（A）和主动脉带鼠标（B）获得的 DICOM 图像连续帧的心肌区域。两个图像的帧速率为 212。对于这些图像，使用 3 个切点评估周期变异性：20 百分位（钻石）、50百分位（平方）和 80百分位数（三角形）。相对周期性变异性对于80百分位值高于较低的切点值。单击此处查看更大的图像。
图4。信号强度分布来自对具有代表性的鼠标和人类图像的单帧分析。直方图显示在假手术后7周（A）、手术后7周主动脉带小鼠（B）、正常感性人（C）和高血压（D）时，从对照鼠心肌中提取的信号强度分布。蓝色垂直线表示20百分位、50百分位和 80百分位数值。对于具有慢性后载应激（即主动脉带与对照小鼠相比，和与正常敏感性人类相比，高血压）的受试者，信号强度的分布是右移的，范围更大。
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图5。图像分析算法生成的代表性数据。（A） 显示与主动脉带（案例）鼠标在 7 周内相比，来自假操作（控制）的数据。（B） 显示与慢性高血压患者（病例）相比，血压正常（控制）的人的数据。心肌与心周信号强度比在算法内使用3种分析方法确定：20个 百分位值的比例：百分位数的 50百 分位值比率;和 80百 分位数值的比例。控制和案例的最大区别表现在使用信号强度的 80 百分位值的比率。
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图6。小鼠之间心肌组织组织学的差异，有或没有暴露在后负荷应激。 代表马森的左心室的三色染色部分显示为接受虚假手术的老鼠（A：控制）和在手术后7周接受主动脉带（B：案例）的老鼠。与对照组相比，各节显示存在大量胶原蛋白沉积和间质纤维化。比例杆表示 50μm。
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Discussion
我们描述图像分析算法的协议，该算法量化声像信号强度分布，进而提供心肌微观结构的替代测量。协议的标准化功能，包括投资回报率和参考区域的选择、大小和定位，有助于最大限度地减少用户和基于主题的变异性。我们证明，当应用于末期舒张单帧回声心电图图像时，该算法可以适当区分正常心肌与暴露在后负荷应力中的心肌。
该协议详细说明了如何使用开源图像J软件包使用该算法。在此图像分析环境中，该算法可用于生成来自给定心肌组织样本的信号强度值分布数据。由此产生的信号强度分布可以以直方图的形式显示。心肌选择中强度值的直方图表明，与非易感心肌相比，患病心肌组织在分布上表现出正确的变化，并且值范围更大。当算法应用于人类和穆林回声心电图图像时，可以看到此模式。
观察到心脏周期中信号强度的变化与心肌密度的生理变化相对应。一种分析方法，一致区分密度变化在整个心脏周期被认为是敏感的心肌密度差异，发生在响应病理过程1，6。事实上，在将算法应用于穆林超声心动图中的连续帧时，会观察到周期性变异性。与总信号强度分布中的较低百分位数相比，在较高时观察到心形强度值的更大变化。
当该算法应用于从具有或不暴露于后载阻力的受试者那里获得的回声心动图图像的代表性样本时，观察到所选百分位数心肌与心室比密度在区分受试者时特别有效，而没有暴露于慢性后载阻力。这一发现是在对具有代表性的鼠标和人类数据的分析中观察到的。心肌密度升高预计将在暴露于慢性后遗症的受试者心肌组织中看到，因为已知这种压力会促进心肌间胶原蛋白沉积和心肌纤维化14的发展。测量心肌组织随着时间的流变而变化，可以更好地理解组织对长期压力和疾病进展的反应。需要进一步研究，以评估信号强度的变化是否与组织学随时间的变化以及给定疾病表型的严重程度增加有关。
图像分析算法的适用性有限，无法对具有会干扰投资回报率和/或参考选择、心内内科边界可视化或整体质量差的人工制品的图像适用性。当百分位数值在灰度映射时显示非线性模式时，或者当使用动态范围不足时，该算法可能无法准确比较心肌和心周区域。尽管此类实例在大多数表型信号强度的10 到90 百分位值内是罕见的，但可能需要对后散射线性和动态范围进行初步评估，以便研究使用非常规超声波技术获得的新的兴趣表型和/或分析获得的图像。该算法还因投资回报率和参考样本选择过程缺乏自动化而受限。此外，该算法在使用明显不同的回声心动图采集参数捕获的图像的交叉比较中使用的能力有限。在本报告中，小鼠的图像是使用18-38 MHz传感器获得的，帧速率在225-247 fps：人类图像是使用1-5 MHz传感器获得的，帧速率从34-54 fps不等。需要进一步研究，以确定使用不同设备获得的图像可能需要的可能协议修订，帧速率明显超过上述报告范围。
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Disclosures
未声明任何利益冲突。
Acknowledgments
我们非常感谢哈佛医学院/布里格姆和妇女医院心血管生理学核心实验室提供的资源。这项工作的部分资金来自国家卫生研究院赠款HL088533、HL071775、HL093148和HL099073（RL）。MB 是美国心脏协会创始人联盟博士后奖学金的获得者。KU 是美国心脏协会创始人附属博士后奖学金的获得者。SC 得到了埃里森基金会的奖励。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ImageJ v 1.46 | NIH (Bethesda, MD) | open access software | |
| Power ShowCase | Trillium Technology (Ann Arbor, MI) | commercial software |
References
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