הקמת הריכוז החיידקי המינימלי של סוכן מיקרוביאלית לתאים פלנקטוניים (MBC-P) ותאי ביופילם (MBC-B)
Summary
פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה באמצעות צלחת מיקרוטיטר 96 באר. חיידקי פלנקטוניים או ביופילם נחשפים לדילול סדרתי של הסוכן האנטי-מיקרוביאלי המועדף. הכדאיות נפגעת על ידי צמיחה על צלחות אגר.
Abstract
פרוטוקול זה מאפשר השוואה ישירה בין התנגדות פלנקטונית וביופילם לזן חיידקי שיכול ליצור ביופילם במבחנה. חיידקים מחוסנים לתוך בארות של צלחת מיקרוטיטר 96-היטב. במקרה של בדיקה פלנקטונית, דילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים השעיות חיידקים. ב biofilm assay, פעם מחוסן, החיידקים נשארים ליצור biofilm על פני תקופה מוגדרת של זמן. תאים לא מחוברים מוסרים מן הבארות, התקשורת מתחדשת ודילול סדרתי של הסוכן מיקרוביאלית של בחירה מתווספים. לאחר חשיפה לסוכן מיקרוביאלית, התאים הפלנקטוניים הם assayed לצמיחה. עבור מבחני הביופילם, התקשורת מתרעננת עם מדיה טרייה חסרה את הסוכן מיקרוביאלית ותאי הביופילם נשארים להתאושש. הכדאיות של תאי הביופילם מתבצעת לאחר תקופת ההחלמה. MBC-P עבור הסוכן מיקרוביאלית מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של סמים שהורג את התאים בתרבות הפלנקטונית. לעומת זאת, MBC-B עבור זן נקבע על ידי חשיפת biofilms מעוצבים מראש לריכוזים הולכים וגדלים של חומר מיקרוביאלית במשך 24 שעות. MBC-B מוגדר כריכוז הנמוך ביותר של חומר מיקרוביאלית שהורג את התאים בביופילם.
Introduction
מבחני עמידות לאנטיביוטיקה פותחו בתחילה כדי לנסות עמידות של תרבויות פלנקטוניות (שחייה חופשית) של חיידקים. מכיוון שזיהומים חיידקיים רבים כרוכים בביופילמים (תאים המחוברים לפני השטח), התעניינו בפיתוח שיטה לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם. עם זאת, רוב מבחני עמידות לאנטיביוטיקה אינם מתאימים למדידת ההתנגדות של biofilms. לדוגמה, קביעת הריכוז המעכב המינימלי (MIC) הוא תקן הזהב לקביעת עמידות לאנטיביוטיקה של תרביות חיידקים פלנקטוניים 1. זה assay כרוך ערבוב תרבות פלנקטונית מדוללת עם סדרת דילול של אנטיביוטיקה. ריכוז האנטיביוטיקה המעכבת את הצמיחה הנראית לעין של התאים הפלנקטוניים הוא ה- MIC. מאז בדיקה זו מסתמכת על עיכוב של צמיחה, מעצם הגדרתו, זה לא יכול לעבוד עם תרביות biofilm, אשר דורש בחינת הרגישות האנטיביוטית של תאים בביופילם גדל מראש. במקום למדוד עיכוב גדילה, מבחני MBC-B המתוארים כאן קובעים את ריכוז האנטיביוטיקה שהורג תאים שכבר קיימים בביופילם. לכן, זו assay שואפת לחקות טיפולים אנטיביוטיים של זיהומים biofilm הוקמה, ולספק תצוגה רלוונטית יותר של עמידות לאנטיביוטיקה חיידקי vivo.
מאז biofilms הם בדרך כלל עמידים יותר לאנטיביוטיקה מאשר תרבויות פלנקטוניות 2-4 , היה צורך לתכנן שיטה המקשרת ישירות את עמידות לאנטיביוטיקה של biofilm לזה של תרבות פלנקטונית. לכן מטרה נוספת של שיטה זו היא להיות מסוגל להשוות ישירות את רמת עמידות לאנטיביוטיקה בין תאים פלנקטוניים וביופילם. מבחני MBC-P ו- MBC-B המתוארים כאן מאפשרים זאת מכיוון שהתאים מתרבתים בתנאים דומים. השתמשנו בשיטה זו כדי לחקור מספר גנים חשובים לעמידות לאנטיביוטיקה ספציפית לביופילם 5-8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
עמידות לאנטיביוטיקה בתאים פלנקטוניים מוגדרת כעלייה בריכוז המעכב המינימלי (MIC) של אנטיביוטיקה עקב שינוי קבוע בתאים (למשל מוטציה). המנגנונים של התנגדות או סובלנות ספציפיים לביופילם שזוהו עד כה הם תוצאה של ביטוי של גנים מסוג בר בתוך biofilms. לפיכך, ההגדרה הקלאסית של התנגדות אינה חלה על ביופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחבר רוצה להודות ללי ג’אנג, שיאן-ג’י לי, אהרון הינץ ואולם קלייטון על העזרה הערכית בכתב היד הזה. מבחנים אלה פותחו בתחילה במעבדתו של ג’ורג’ אוטול, בית הספר לרפואה גייזל בדארטמות’. המחקר במעבדתו של ד”ר מאה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה וסיסטיק פיברוזיס קנדה.
Materials
|
1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
||
|
KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
|
|
K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
|
|
(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
|
|
Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
|
Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
|
|
Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
|
96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
|
Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
|
Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
- Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. Antibiotic resistance of bacterial biofilms. Int. J. Antimicrob. Agents. 35 (4), 322-332 (2010).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
- Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
- Zhang, L., Mah, T. F. The Involvement of a Novel Efflux System in Biofilm-Specific Resistance to Antibiotics. J. Bacteriol. 190 (13), 4447-4452 (2008).
- Zhang, L., Hinz, A. J., Nadeau, J. P., Mah, T. F. Pseudomonas aeruginosa tssC1 Links Type VI Secretion and Biofilm-specific Antibiotic Resistance. J. Bacteriol. 193 (19), 5510-5513 (2011).
- Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The Biofilm-Specific Antibiotic Resistance Gene, ndvB, is Important for Expression of Ethanol Oxidation Genes in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
- O’Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Lewis, K. Multidrug tolerance of biofilms and persister cells. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 322, 107-131 (2008).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and Analyzing Static Biofilms. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.1.1-1B.1.17 (2005).
- Ramey, B. E., Parsek, M. R. Chapter 1. Growing and analyzing biofilms in fermenters. Curr. Protoc. Microbiol. 1, 1B.3.1-1B.3.14 (2005).
