Stabilire la concentrazione battericida minima di un agente antimicrobico per cellule planctoniche (MBC-P) e cellule biofilm (MBC-B)
Summary
Questo protocollo consente un confronto diretto tra resistenza planctonica e biofilm per un ceppo batterico che può formare un biofilm in vitro utilizzando una piastra microtitere a 96 pozzoli. I batteri planctonici o biofilm sono esposti a diluizioni seriali dell’agente antimicrobico di scelta. La vitalità è dimostrata dalla crescita sulle piastre di agar.
Abstract
Questo protocollo consente un confronto diretto tra resistenza planctonica e biofilm per un ceppo batterico in grado di formare un biofilm in vitro. I batteri vengono inoculati nei pozzi di una piastra di microtitolo da 96 po ‘. Nel caso del saggio planctonico, alle sospensioni batteriche vengono aggiunte diluizioni seriali dell’agente antimicrobico di scelta. Nel saggio del biofilm, una volta inoculato, i batteri vengono lasciati a formare un biofilm per un determinato periodo di tempo. Le cellule non attaccate vengono rimosse dai pozzi, il supporto viene rifornito e vengono aggiunte diluizioni seriali dell’agente antimicrobico di scelta. Dopo l’esposizione all’agente antimicrobico, le cellule planctoniche vengono studiate per la crescita. Per il saggio del biofilm, il supporto viene rinfrescato con nuovi mezzi privi dell’agente antimicrobico e le cellule del biofilm vengono lasciate recuperare. La vitalità delle cellule biofilm viene saggiata dopo il periodo di recupero. L’MBC-P per l’agente antimicrobico è definito come la più bassa concentrazione di farmaco che uccide le cellule nella coltura planctonica. Al contrario, l’MBC-B per un ceppo è determinato esponendo biofilm preformati ad concentrazioni crescenti di agente antimicrobico per 24 ore. L’MBC-B è definito come la più bassa concentrazione di agente antimicrobico che uccide le cellule nel biofilm.
Introduction
I test di resistenza agli antibiotici sono stati inizialmente sviluppati per saggiare la resistenza delle colture planctoniche (a nuoto libero) dei batteri. Poiché molte infezioni batteriche coinvolgono biofilm (cellule attaccate alla superficie), eravamo interessati a sviluppare un metodo per saggiare la resistenza agli antibiotici specifica del biofilm. Tuttavia, la maggior parte dei test di resistenza agli antibiotici sono poco adatti per misurare la resistenza dei biofilm. Ad esempio, determinare la concentrazione inibitoria minima (MIC) è il gold standard per determinare la resistenza agli antibiotici delle colture batteriche planctoniche 1. Questo saggio comporta la miscelazione di una coltura planctonica diluita con una serie di diluizione di antibiotici. La concentrazione di antibiotico che inibisce la crescita visibile delle cellule planctoniche è il MIC. Poiché questo saggio si basa sull’inibizione della crescita, per definizione, non può funzionare con colture di biofilm, il che richiede l’esame della sensibilità antibiotica delle cellule in un biofilm precarato. Invece di misurare l’inibizione della crescita, il saggio MBC-B qui descritto determina la concentrazione di antibiotici che uccide le cellule già esistenti in un biofilm. Pertanto, questo test mira a imitare i trattamenti antibiotici delle infezioni da biofilm accertate e fornire una visione più pertinente della resistenza agli antibiotici batterici in vivo.
Poiché i biofilm sono generalmente più resistenti agli antibiotici rispetto alle colture planctoniche 2-4 , è stato necessario escogitare un metodo che mette direttamente in relazione la resistenza antibiotica di un biofilm a quella di una coltura planctonica. Quindi un altro obiettivo di questo metodo è quello di essere in grado di confrontare direttamente il livello di resistenza agli antibiotici tra cellule planctoniche e biofilm. I test MBC-P e MBC-B qui descritti lo rendono possibile perché le cellule sono coltivate in condizioni simili. Abbiamo utilizzato questo metodo per studiare diversi geni che sono importanti per la resistenza agli antibiotici specifica del biofilm 5-8 .
Protocol
Representative Results
Discussion
La resistenza agli antibiotici nelle cellule planctoniche è definita come un aumento della concentrazione inibitoria minima (MIC) di un antibiotico a causa di un cambiamento permanente nelle cellule(ad esempio una mutazione). I meccanismi di resistenza o tolleranza specifici del biofilm che sono stati identificati fino ad oggi sono il risultato dell’espressione di geni di tipo selvatico all’interno dei biofilm. Pertanto, la definizione classica di resistenza non si applica ai biofilm. Tuttavia, è stata present…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’autore desidera ringraziare Li Zhang, Xian-Zhi Li, Aaron Hinz e Clayton Hall per l’aiuto editoriale con questo manoscritto. Questo saggio è stato inizialmente sviluppato nel laboratorio di George O’Toole, Geisel School of Medicine al Dartmouth. La ricerca nel laboratorio del Dr. Mah è supportata da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada e della Cistica Fibrosis Canada.
Materials
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1x M63 |
Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. |
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KH2PO4 |
Fisher |
P285-500 |
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K2HPO4 |
Fisher |
P288-500 |
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(NH4)2SO4 |
Sigma |
A5132 |
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Magnesium sulfate |
Fisher |
M63-500 |
Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
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Tobramycin |
Sigma |
Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C. |
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|
Arginine |
Sigma |
A5131 |
Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
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96-well microtiter plates |
Corning |
3595 |
Sterile, flat-bottom, low evaporation |
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Tranferpette (multichannel pipette) |
BrandTech |
2703610 |
8-channel, 20-200 μl |
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Multiprong device |
Dan-Kar |
MC48 |
48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate |
References
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