Etablering av minimal bakteriedrepende konsentrasjon av et antimikrobielt middel for planktonceller (MBC-P) og biofilmceller (MBC-B)

Summary

Denne protokollen muliggjør en direkte sammenligning mellom planktonisk og biofilmmotstand for en bakteriestamme som kan danne en biofilm in vitro ved hjelp av en 96-brønns mikrotiterplate. Planktoniske eller biofilmbakterier er utsatt for serielle fortynninger av det antimikrobielle middelet du velger. Levedyktighet er analysert av vekst på agarplater.

Abstract

Denne protokollen gir en direkte sammenligning mellom planktonisk og biofilmmotstand for en bakteriestamme som kan danne en biofilm in vitro. Bakterier inokulerer i brønnene til en 96-brønns mikrotiterplate. Når det gjelder den planktoniske analysen, legges serielle fortynninger av det antimikrobielle middelet til bakterielle suspensjoner. I biofilmanalysen, når de er inokulert, blir bakteriene igjen for å danne en biofilm over en bestemt tidsperiode. Uattrerte celler fjernes fra brønnene, mediet etterfylles og serielle fortynninger av det antimikrobielle middelet som velges, tilsettes. Etter eksponering for det antimikrobielle middelet blir de planktoniske cellene analysert for vekst. For biofilmanalysen oppdateres mediene med friske medier som mangler det antimikrobielle middelet, og biofilmcellene blir igjen for å komme seg. Biofilmcelle levedyktighet er analysert etter gjenopprettingsperioden. MBC-P for det antimikrobielle middelet er definert som den laveste konsentrasjonen av stoff som dreper cellene i den planktoniske kulturen.  I motsetning bestemmes MBC-B for en stamme ved å utsette preformerte biofilmer for å øke konsentrasjonen av antimikrobielt middel i 24 timer. MBC-B er definert som den laveste konsentrasjonen av antimikrobielt middel som dreper cellene i biofilmen.

Introduction

Antibiotisk resistensanalyser ble opprinnelig utviklet for å analyseresistens av planktoniske (frisvømming) kulturer av bakterier. Siden mange bakterielle infeksjoner involverer biofilmer (overflatetilknyttet celler), var vi interessert i å utvikle en metode for å analyse biofilmspesifikk antibiotikaresistens. Imidlertid er de fleste antibiotikaresistensanalyser dårlig egnet for å måle motstanden til biofilmer. For eksempel er det å bestemme den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC) gullstandarden for å bestemme antibiotikaresistens av planktoniske bakteriekulturer ¹. Denne analysen innebærer å blande en fortynnet planktonisk kultur med en fortynningsserie av antibiotika.  Konsentrasjonen av antibiotika som hemmer den synlige veksten av de planktoniske cellene er MIC. Siden denne analysen er avhengig av inhibering av vekst, kan den per definisjon ikke fungere med biofilmkulturer, noe som krever å undersøke antibiotikafølsomheten til celler i en forgrodd biofilm. I stedet for å måle veksthemming, bestemmer MBC-B-analysen som er beskrevet her konsentrasjonen av antibiotika som dreper celler som allerede eksisterer i en biofilm. Dermed har denne analysen som mål å etterligne antibiotikabehandlinger av etablerte biofilminfeksjoner, og gi et mer relevant syn på bakteriell antibiotikaresistens in vivo.

Siden biofilmer generelt er mer antibiotikaresistente enn planktoniske kulturer ^2-4 , var det nødvendig å utarbeide en metode som direkte relaterer antibiotikaresistensen til en biofilm til en planktonisk kultur. Dermed er et annet mål med denne metoden å kunne sammenligne nivået av antibiotikaresistens direkte mellom planktoniske og biofilmceller. MBC-P- og MBC-B-analysene som er beskrevet her, gjør dette mulig fordi cellene dyrkes under lignende forhold. Vi har brukt denne metoden til å studere flere gener som er viktige for biofilmspesifikk antibiotikaresistens ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B Voksende en biofilm (tilpasset fra O’Toole9). Vokse en kultur av vill type stamme av interesse og mutant belastning for 16 timer i et rikt medium ved 37 °C. Fortynn de mettede nattkulturene 1:100 i friskt medium for antibiotikaresistensanalyser. Et standardmedium for P. aeruginosa er M63 minimalt medium supplert med magnesiumsulfat og arginin (se tabell 1). Dette mediet stimulerer dannelsen av en mer robust bi…

Representative Results

MBC-P- og MBC-B-analyser ble utført, og sammenlignet følsomheten til PA14 vill type med PA14 ∆ndvB. Tobramycin ble brukt som antibiotika. Resultater som tilsvarer trinn 1.4.4 (figur 1) og trinn 2.3.4 (figur 2) presenteres. PA14 og ∆ndvB ble inokulert i MBC-P- og MBC-B-analysene i triplikat. Etter å ha fullført trinn 1.0-1.4 i MBC-B-protokollen og trinn 2.0-2.3 i MBC-P-protokollen, ble de levedyktige cellene belagt på en LB-agarplate. Konsentrasjoner av tobramyc…

Discussion

Antibiotikaresistens i planktoniske celler er definert som en økning i minimum hemmende konsentrasjon (MIC) av et antibiotikum på grunn av en permanent endring i cellene(f.eks. en mutasjon). Mekanismene for biofilmspesifikk motstand eller toleranse som hittil er identifisert, er et resultat av uttrykket av ville gen i biofilmer. Dermed gjelder den klassiske definisjonen av motstand ikke biofilmer. Imidlertid har et annet sett med definisjoner blitt presentert: motstandsmekanismer hindrer antibiotika i å få t…

Materials

1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate