Etablering af minimal baktericidkoncentration af et antimikrobielt middel til planktoniske celler (MBC-P) og biofilmceller (MBC-B)

Summary

Denne protokol giver mulighed for en direkte sammenligning mellem planktonisk og biofilmresistens for en bakteriestamme, der kan danne en biofilm in vitro ved hjælp af en 96-brønds mikrotiterplade. Planktoniske eller biofilmbakterier udsættes for serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel. Levedygtigheden dæmpes af vækst på agarplader.

Abstract

Denne protokol giver mulighed for en direkte sammenligning mellem planktonisk og biofilmresistens for en bakteriestamme, der kan danne en biofilm in vitro. Bakterier er podet ind i brøndene i en 96-godt mikrotiter plade. I tilfælde af planktonisk analyse tilsættes serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel til bakterieophængene. I biofilmanalysen, når de er podet, overlades bakterierne til at danne en biofilm over en bestemt periode. Ikke-vedhæftede celler fjernes fra brøndene, mediet genopfyldes, og der tilsættes serielle fortyndinger af det valgte antimikrobielle middel. Efter udsættelse for antimikrobielt middel analyseres planktoncellerne for vækst. For biofilmanalysen opdateres medierne med friske medier, der mangler antimikrobielt middel, og biofilmcellerne er overladt til at komme sig. Biofilmcelles levedygtighed analyseres efter genfindingsperioden. MBC-P for antimikrobielt middel er defineret som den laveste koncentration af stof, der dræber cellerne i planktonkulturen.  I modsætning hertil bestemmes MBC-B for en stamme ved at udsætte præformerede biofilm for stigende koncentrationer af antimikrobielt middel i 24 timer. MBC-B defineres som den laveste koncentration af antimikrobielt middel, der dræber cellerne i biofilmen.

Introduction

Antibiotikaresistens assays blev oprindeligt udviklet til at analysere resistens planktoniske (fri-svømning) kulturer af bakterier. Da mange bakterielle infektioner involverer biofilm (overflade-vedhæftede celler), var vi interesseret i at udvikle en metode til at analysere biofilm-specifikke antibiotikaresistens. Men de fleste antibiotikaresistens assays er dårligt egnet til måling af resistens af biofilm. For eksempel er bestemmelse af den minimale hæmmende koncentration (MIC) guldstandarden til bestemmelse af antibiotikaresistens af planktoniske bakteriekulturer ¹. Denne analyse indebærer blanding af en fortyndet planktonisk kultur med en fortynding serie af antibiotika.  Koncentrationen af antibiotika, der hæmmer den synlige vækst af planktoniske celler er MIC. Da denne analyse er afhængig af hæmning af vækst, kan den pr. definition ikke fungere med biofilmkulturer, hvilket kræver undersøgelse af cellernes antibiotikafølsomhed i en forgroet biofilm. I stedet for at måle væksthæmmende, MBC-B assay beskrevet her bestemmer koncentrationen af antibiotika, der dræber celler, der allerede findes i en biofilm. Således har denne analyse til formål at efterligne antibiotikabehandlinger af etablerede biofilminfektioner og give et mere relevant billede af bakteriel antibiotikaresistens in vivo.

Da biofilm generelt er mere antibiotikaresistente end planktoniske kulturer ^2-4 , var det nødvendigt at udtænke en metode, der direkte relaterer antibiotikaresistensen af en biofilm til en planktonisk kultur. Et andet mål med denne metode er således at være i stand til direkte at sammenligne niveauet af antibiotikaresistens mellem planktoniske og biofilmceller. De MBC-P og MBC-B assays, der er beskrevet her, gør dette muligt, fordi celler dyrkes under lignende forhold. Vi har brugt denne metode til at studere flere gener, der er vigtige for biofilmspecifik antibiotikaresistens ^5-8 .

Protocol

1. MBC-B Dyrkning af en biofilm (tilpasset fra O’Toole9). Der dyrkes en kultur af den vilde stamme af interesse og mutantstamme i 16 timer i et rigt medium ved 37 °C. Fortynd den mættede natten kulturer 1:100 i frisk medium for antibiotikaresistens assays. Et standardmedium til P. aeruginosa er M63 minimalt medium suppleret med magnesiumsulfat og arginin (se tabel 1). Dette medium stimulerer dannelsen af en mere robus…

Representative Results

MBC-P og MBC-B assays blev udført, sammenligne følsomhed PA14 vilde type med PA14 ∆ndvB. Tobramycin blev brugt som antibiotikum. Der præsenteres resultater svarende til trin 1.4.4 (figur 1) og trin 2.3.4 (figur 2). PA14 og ∆ndvB blev podet ind i MBC-P og MBC-B assays i tre eksemplarer. Efter at have fuldført trin 1.0-1.4 i MBC-B-protokollen og trin 2.0-2.3 i MBC-P-protokollen blev de levedygtige celler belagt på en LB agarplade. Koncentrationer af tobramycin (<…

Discussion

Antibiotikaresistens i planktoniske celler defineres som en stigning i den minimale hæmmende koncentration (MIC) af et antibiotikum på grund af en permanent ændring i cellerne(f.eks. en mutation). Mekanismerne for biofilmspecifik resistens eller tolerance, der er blevet identificeret til dato, er resultatet af ekspressionen af vilde typegener i biofilm. Den klassiske definition af resistens gælder således ikke for biofilm. Der er imidlertid blevet fremlagt et andet sæt definitioner: Resistensmekanismer for…

Materials

1x M63			Prepare as a 5x M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature.  Dilute 5x stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components.
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
Magnesium sulfate	Fisher	M63-500	Add to 1 mM final concentration.  Prepare as a 1 M stock in water and autoclave.
Tobramycin	Sigma		Prepare 50 mg/m stock. Aliquot and store at –20°C.
Arginine	Sigma	A5131	Add to 0.4% final concentration.  Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize.  This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids
96-well microtiter plates	Corning	3595	Sterile, flat-bottom, low evaporation
Tranferpette (multichannel pipette)	BrandTech	2703610	8-channel, 20-200 μl
Multiprong device	Dan-Kar	MC48	48 prongs fit into ½ of a 96-well microtiter plate