ניתוח שיטתי של<em> במבחנה</em> תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם
Summary
מחקר זה השתמש במערכת microfluidic צלחת רב גם, להגדיל באופן משמעותי את התפוקה של מחקרים מתגלגלים תא תחת זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית. לאור החשיבות של מתגלגל תא בתא רב שלבי ביות מפל ואת החשיבות של ביות התא הבאה משלוח מערכתי של אוכלוסיות אקסוגניים של תאים בחולים, מערכת זו מציעה פוטנציאל כפלטפורמת הקרנה כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים.
Abstract
אתגר גדול לטיפול מבוסס תאים הוא חוסר היכולת למקד מערכתי כמות גדולה של תאי קיימא עם יעילות גבוהה לרקמות של העניין הבא עירוי תוך ורידי או intraarterial. כתוצאה מכך, הגדלת ביות תא כרגע למד כאסטרטגיה כדי לשפר את הטיפול בתאים. תא מתגלגל על האנדותל של כלי הדם הוא צעד חשוב בתהליך של ביות של תאים ויכול להיות נחקר במבחנה באמצעות זרימת צלחת קאמרית מקבילה (PPFC). עם זאת, זה assay תפוקה משעמם מאוד, נמוך, עם תזרים תנאים מבוקרים היטב. במקום זאת, השתמשנו במערכת microfluidic צלחת רב גם המאפשרת חקר התכונות מתגלגלים סלולארי בתפוקה גבוהה יותר תחת מבוקרת בדיוק, זרימת גזירה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית 1,2. במאמר זה, אנו מראים כיצד המאפיינים המתגלגלים של HL-60 (לוקמיה פרומיילוציטית האנושית) תאים על משטחי E-מצופה selectin P-וכמו גם על משטחים מצופים monolayer תא יכולים להיות readily שנבדק. כדי לדמות טוב יותר במצבים דלקתיים, משטח ערוץ microfluidic היה מצופה בתאי האנדותל (ECS), אשר לאחר מכן הופעלו עם הגורם-α גידול הנמק (TNF-α), להגדיל באופן משמעותי את אינטראקציות עם HL-60 תאים בתנאים דינמיים. התפוקה המשופרת ופלטפורמה משולבת רב פרמטר ניתוח תוכנה, המאפשרת ניתוח מהיר של פרמטרים כגון מתגלגל מהירויות ומתגלגלים בדרך, הן יתרונות חשובים להערכת מאפייני תא מתגלגל חוץ גופייה. המאפשר ניתוח מהיר ומדויק של גישות הנדסיות שנועדו להשפיע מתגלגל תא וביות, פלטפורמה זו עשויה לסייע בטיפול מבוסס תאים אקסוגניים מראש.
Introduction
אחד האתגרים המרכזיים בתרגום הקליני המוצלח של טיפול מבוסס תאים הוא המסירה יעילה או מיקוד של תאים חדורים מערכתית לאתרים רצויים 3,4. כתוצאה מכך, יש חיפוש מתמיד אחר גישות כדי לשפר את הביות של תאים, ותאים במיוחד מתגלגל, כאסטרטגיה לשיפור טיפול בתא. תא מתגלגל על כלי דם הוא צעד מפתח במפל ביות תא, באופן קלאסי המוגדר לויקוציטים שמגויסים לאתרי מחלה 5. צעד זה נשלטת על ידי אינטראקציות ספציפיות בין selectins אנדותל, כלומר P-ו-E-selectin (P-ו-E-SEL), וligands המתפרץ שלהם על פני השטח של כדוריות דם לבנות 5,6. הבנה טובה יותר ויעילות משופרת של ביות תא, ובאופן ספציפי את הצעד מתגלגל, הם בעלי חשיבות רבה בחיפוש אחר פלטפורמות חדשות כדי לשפר את הטיפול המבוסס על תאים. למועד זה הושג על ידי שימוש בתאים במקביל זרימת צלחת (PPFCs), הכוללת שני פלאט השטוחes עם אטם ביניהם, עם נמל יבוא ו יצוא ממוקם על הצלחת העליונה, שדרכו השעיה תא perfused באמצעות מזרק לשאוב 7,8, 9. פני השטח של הצלחת התחתונה יכולים להיות מצופה עם monolayer התא / מצעים רלוונטיים והאינטראקציה בין תאי perfused והשטח תחת זרימת גזירה היא לאחר מכן בחן 7. עם זאת, PPFC היא תפוקה נמוכה, מגיב בעליות, ושיטה מייגעת למדי, עם היווצרות בועה, נזילה ותזרים מבוקר היטב הצגת חסרונות עיקריים.
טכניקה חלופית לPPFC המסורתי היא מערכת microfluidic צלחת רבת היטב, המאפשר ביצועים גבוהים יותר תפוקה של מבחני סלולריים (גבוהים יותר עד פי 10 מ PPFCs) תחת זרימת גזירה מדויקת, מבוקר מחשב, עם הצריכה נמוכה מגיב 1,10. ניסויים מתגלגלים תא מבוצעים בתוך ערוצי microfluidic, שיכול להיות מצופה עם monolayers תא או מצעים מהונדסים וצלם USIng מיקרוסקופ, עם מאפיינים מתגלגלים בקלות נותח באמצעות תוכנה מתאימה. במחקר זה, אנו מדגימים את היכולות של מערכת צלחת רב גם זה microfluidic על ידי בוחן את המאפיינים המתגלגלים של לוקמיה פרומיילוציטית האנושית (HL-60) תאים על משטחים שונים. HL-60 מתגלגל על מצעים כמו P-ו-E-sel, כמו גם על משטחי תא לבטא קולטנים מתגלגלים שונים, נותחו. בנוסף, נוגדנים (Ab) חסימה שימשו להפגין מעורבות ישירה של selectins הספציפי בתיווך תנועת הגלגול של HL-60 על משטחים אלו. ניסויים מתגלגלים בוצעו עם תפוקה מוגברת, תחת זרימת גזירה יציבה, עם הצריכה מגיב / תא מינימאלי, המאפשרים ניתוח יעיל של פרמטרים מתגלגלים מפתח כגון מהירות מתגלגלת, מספר התאים מתגלגלים, ומאפייני דרך מתגלגלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד האתגרים המרכזיים בתרגום מוצלח של טיפול מבוסס תאי אקסוגני הוא חוסר היכולת לספק תאים ביעילות לאתרים של פגיעה ודלקת הגבוה engraftment יעילות 3. מתגלגל תא מייצג שלב קריטי בתהליך של ביות של תאים, להקל על ההאטה של תאים בדפנות כלי דם, סופו של דבר מוביל להידבקות המשרד וגל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
תאי CHO-P היו מתנת סוג של ד"ר ברברה Furie (ישראל דיקונס מרכז רפואי, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק HL095722 לJMK עבודה זו נתמכה גם בחלק סרטן קרן אתגר פרס Movember-ערמונית לJMK ידי
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
