التحليل المنهجي لل<em> في المختبر</em> الخليوي المتداول باستخدام نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا
Summary
تستخدم هذه الدراسة نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا، وزيادة الإنتاجية بشكل كبير من الدراسات خلية المتداول تحت تدفق القص ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. نظرا لأهمية الخلية المتداول في الخلية متعددة الخطوات صاروخ موجه تتالي وأهمية صاروخ موجه الخلية بعد تسليم النظامية من السكان خارجية من الخلايا في المرضى، وهذا النظام يوفر إمكانية كمنبر الفحص لتحسين العلاج القائم على الخلية.
Abstract
ويتمثل التحدي الرئيسي للعلاج القائم على الخلية هو عدم القدرة على استهداف بشكل منتظم كمية كبيرة من خلايا قابلة للحياة ذات كفاءة عالية لأنسجة الفائدة التالية التسريب في الوريد أو الشرياني. وبالتالي، زيادة صاروخ موجه الخلية تدرس حاليا كاستراتيجية لتحسين العلاج بالخلايا. الخلية المتداول على بطانة الأوعية الدموية هي خطوة هامة في عملية صاروخ موجه الخلية ويمكن بحثها في المختبر باستخدام تدفق موازية لوحة غرفة (PPFC). ومع ذلك، وهذا هو مملة للغاية، والإنتاجية المنخفضة الفحص، مع ظروف تدفق تسيطر بشكل سيئ. بدلا من ذلك، استخدمنا نظام ميكروفلويديك لوحة متعددة جيدا أن تمكن دراسة الخصائص الخلوية المتداول في إنتاجية أعلى تحت تسيطر على وجه التحديد، ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية تدفق القص 1،2. في هذه الورقة، وتبين لنا كيف أن خصائص المتداول من HL-60 (اللوكيميا الإنسان) الخلايا على الأسطح المطلية E-selectin-P وكذلك على الخلايا المغلفة السطوح يمكن أن يكون أحادي الطبقة readilدرست ذ. لمحاكاة أفضل الحالات الالتهابية، والمغلفة سطح قناة ميكروفلويديك مع الخلايا البطانية (ECS)، ثم جرى تفعيلها مع عامل نخر الورم-α (TNF-α)، زيادة كبيرة في التفاعل مع HL-60 الخلايا تحت الظروف الديناميكية. الإنتاجية المعززة والمتكاملة متعددة المعلمة منصة تحليل البرامج، التي تسمح التحليل السريع من المعلمات مثل المتداول السرعات والمتداول المسار، ومزايا هامة لتقييم الخلية المتداول خصائص في المختبر. يسمح تحليل سريع ودقيق الأساليب الهندسية المصممة للتأثير المتداول الخلية وصاروخ موجه، هذا المنبر قد يساعد العلاج القائم على الخلية الخارجية مسبقا.
Introduction
واحدة من التحديات الرئيسية في الترجمة السريرية نجاح العلاج القائم على الخلية هو تسليم غير فعال أو استهداف الخلايا التي غرست بشكل منتظم لمواقع المطلوب 3،4. وبالتالي، هناك بحث دائم عن النهج لتحسين صاروخ موجه الخلية، والخلية تحديدا المتداول، كاستراتيجية لتحسين العلاج بالخلايا. الخلية المتداول على الأوعية الدموية هي خطوة رئيسية في سلسلة الخلية صاروخ موجه، تعريف كلاسيكي للالكريات البيض التي يتم تجنيدهم للمواقع المرض 5. ويخضع هذا خطوة محددة التفاعلات بين selectins البطانية، أي ف وE-selectin (P-E-وقانون حالة الطوارئ)، وبروابط المرتدة على سطح الكريات البيض 5،6. فهم أفضل وتحسين كفاءة الخلية صاروخ موجه، وعلى وجه التحديد الخطوة المتداول، هي ذات أهمية كبيرة في السعي لمنصات جديدة لتحسين العلاج القائم على الخلية. حتى الآن هذا تم تحقيقه عن طريق استخدام لوحة موازية غرف تدفق (PPFCs)، التي تضم اثنين من بلات شقةوفاق مع طوقا بينهما، مع منفذ تدفق وتدفق تقع على لوحة العلوي، والتي من خلالها يتم perfused تعليق خلية وباستخدام حقنة لضخ 7،8، 9. سطح اللوحة السفلي يمكن أن تكون مغلفة مع أحادي الطبقة خلية / ركائز ذات الصلة والتفاعل بين الخلايا perfused والسطح تحت تدفق القص ثم يتم استكشافها 7. ومع ذلك، PPFC هو الإنتاجية منخفضة، كاشف المستهلكة، وطريقة مملة إلى حد ما، مع تشكيل فقاعة، والتسرب، وتدفق سيئة تسيطر تقديم العوائق الرئيسية.
تقنية بديلة للPPFC التقليدية هو لوحة النظام ميكروفلويديك متعددة جيدا، والسماح أداء أعلى من الإنتاجية المقايسات الخلوية (أعلى ما يصل إلى 10 مرة من PPFCs) تحت دقيقة، الكمبيوتر التي تسيطر عليها تدفق القص، مع انخفاض استهلاك كاشف 1،10. وتجرى التجارب المتداول خلية داخل قنوات ميكروفلويديك، والتي يمكن أن تكون مغلفة مع الطبقات الوحيدة الخلية أو ركائز هندسيا وتصويرها باليودنانوغرام المجهر، مع خصائص المتداول تحليلها بسهولة باستخدام البرمجيات المناسبة. في هذه الدراسة، ونحن لشرح قدرات هذا النظام لوحة ميكروفلويديك متعددة جيدا من خلال دراسة خصائص المتداول من اللوكيميا الإنسان (HL-60) الخلايا على الأسطح المختلفة. HL-60 المتداول على ركائز مثل P و E-SEL، فضلا عن الطبقات الوحيدة الخلية التعبير عن مستقبلات المتداول مختلفة، تم تحليلها. بالإضافة إلى ذلك، تم الأضداد (أب) تستخدم الحجب لإثبات المشاركة المباشرة من selectins محددة في التوسط في الحركة المتداول من HL-60 على تلك السطوح. وأجريت التجارب المتداول مع زيادة الإنتاجية، في ظل تدفق مستقر القص، مع الحد الأدنى من استهلاك كاشف / خلية، مما يتيح تحليل كفاءة المعلمات المتداول الرئيسية مثل سرعة المتداول، وعدد الخلايا المتداول، والمتداول خصائص المسار.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحدة من التحديات الرئيسية في الترجمة الناجحة من العلاج القائم على الخلية الخارجية هو عدم القدرة على تقديم الخلايا بكفاءة إلى مواقع الإصابة والتهاب ذات كفاءة عالية engraftment 3. يمثل المتداول خلية خطوة حاسمة في عملية صاروخ موجه الخلية، وتسهيل تباطؤ الخلايا على جدر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كانت الخلايا CHO-P هدية عينية من الدكتور باربرا Furie (مركز بيث إسرائيل ديكونيس الطبي، كلية الطب بجامعة هارفارد). وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة HL095722 منحة لJMK وأيد هذا العمل أيضا في جزء من جائزة التحدي مؤسسة سرطان البروستاتا لMovember-JMK
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
- Conant, C. G., et al. Well plate microfluidic system for investigation of dynamic platelet behavior under variable shear loads. Biotechnol. Bioeng. 108, 2978-2987 (2011).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Ionescu-Zanetti, C. Well plate-coupled microfluidic devices designed for facile image-based cell adhesion and transmigration assays. J. Biomol. Screen. 15, 102-106 (2010).
- Ankrum, J., Karp, J. M. Mesenchymal stem cell therapy: Two steps forward, one step back. Trends Mol. Med. 16, 203-209 (2010).
- Karp, J. M., Leng Teo, G. S. Mesenchymal stem cell homing: the devil is in the details. Cell Stem Cell. 4, 206-216 (2009).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).
- Ley, K. The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol. Med. 9, 263-268 (2003).
- Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416 (06), 346-371 (2006).
- Brown, D. C., Larson, R. S. Improvements to parallel plate flow chambers to reduce reagent and cellular requirements. BMC Immunol. 2, 9 (2001).
- Lawrence, M. B., McIntire, L. V., Eskin, S. G. Effect of flow on polymorphonuclear leukocyte/endothelial cell adhesion. Blood. 70, 1284-1290 (1987).
- Conant, C. G., Schwartz, M. A., Nevill, T., Ionescu-Zanetti, C. Platelet adhesion and aggregation under flow using microfluidic flow cells. J. Vis. Exp. (10), e1644 (2009).
- Furie, B., Furie, B. C. Role of platelet P-selectin and microparticle PSGL-1 in thrombus formation. Trends Mol. Med. 10, 171-178 (2004).
- Tchernychev, B., Furie, B., Furie, B. C. Peritoneal macrophages express both P-selectin and PSGL-1. J. Cell Biol. 163, 1145-1155 (2003).
- Conant, C. G., et al. Using well-plate microfluidic devices to conduct shear-based thrombosis assays. J Lab Autom. 16, 148-152 (2011).
- Larsen, G. R., et al. P-selectin and E-selectin. Distinct but overlapping leukocyte ligand specificities. J. Biol. Chem. 267, 11104-11110 (1992).
- Varki, A. Selectin ligands: will the real ones please stand up. J. Clin. Invest. 100, S31-S35 (1997).
- Bohnsack, J. F., Chang, J. Activation of beta 1 integrin fibronectin receptors on HL60 cells after granulocytic differentiation. Blood. 83, 543-552 (1994).
- Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E). J. Cell Biol. 136, 717-727 (1997).
- Moore, K. L., et al. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates rolling of human neutrophils on P-selectin. J. Cell Biol. 128, 661-671 (1995).
- Lawrence, M. B., Springer, T. A. Neutrophils roll on E-selectin. J Immunol. 151, 6338-6346 (1993).
- Yao, L., et al. Divergent inducible expression of P-selectin and E-selectin in mice and primates. Blood. 94, 3820-3828 (1999).
- Sackstein, R. Glycoengineering of HCELL, the human bone marrow homing receptor: sweetly programming cell migration. Ann. Biomed. Eng. 40, 766-776 (2012).
- Wiese, G., Barthel, S. R., Dimitroff, C. J. Analysis of physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling on microvascular endothelium. J. Vis. Exp. , e1009 (2009).
- Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods Enzymol. 443, 155-176 (2008).
- Bakker, D. P., vander Plaats, A., Verkerke, G. J., Busscher, H. J., vander Mei, H. C. Comparison of velocity profiles for different flow chamber designs used in studies of microbial adhesion to surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 69, 6280-6287 (2003).
- Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New device for high-throughput viability screening of flow biofilms. Appl. Environ. Microbiol. 76, 4136-4142 (2010).
- Varki, A. Selectin ligands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 7390-7397 (1994).
- Ramos, C. L., et al. Direct demonstration of P-selectin- and VCAM-1-dependent mononuclear cell rolling in early atherosclerotic lesions of apolipoprotein E-deficient mice. Circ. Res. 84, 1237-1244 (1999).
- Yago, T., et al. Core 1-derived O-glycans are essential E-selectin ligands on neutrophils. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, (2010).
- Yago, T., et al. E-selectin engages PSGL-1 and CD44 through a common signaling pathway to induce integrin alphaLbeta2-mediated slow leukocyte rolling. Blood. 116, 485-494 (2010).
- Simone, G., et al. Cell rolling and adhesion on surfaces in shear flow. A model for an antibody-based microfluidic screening system. Microelectronic Eng. 98, 668-671 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic devices modulate tumor cell line susceptibility to NK cell recognition. Small. 8, 2886-2894 (2012).
- Perozziello, G., et al. Microfluidic biofunctionalisation protocols to form multivalent interactions for cell rolling and phenotype modification investigations. Electrophoresis. , (2013).
- Simone, G., et al. A facile in situ microfluidic method for creating multivalent surfaces: toward functional glycomics. Lab Chip. 12, 1500-1507 (2012).
- Sarkar, D., et al. Engineered cell homing. Blood. 118, e184-e191 (2011).
- Cheng, Z., et al. Targeted Migration of Mesenchymal Stem Cells Modified With CXCR4 Gene to Infarcted Myocardium Improves Cardiac Performance. Mol. Ther. 16, 571-579 (2008).
- Enoki, C., et al. Enhanced mesenchymal cell engraftment by IGF-1 improves left ventricular function in rats undergoing myocardial infarction. Int. J. Cardiol. 138, 9-18 (2010).
