の体系的な分析<em>体外</emマルチウェルプレートマイクロ流体システムを使用して>セルローリング
Summary
この研究は、有意に生理学的に関連するせん断流の下で細胞ローリング研究のスループットを向上させる、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムを用いる。カスケードおよび患者における細胞の外因集団の全身送達後の細胞のホーミングの重要性をホーミング多段階の細胞における細胞ローリングの重要性を考えると、このシステムは、細胞ベースの治療を改善するためのスクリーニングプラットフォームとしての可能性を提供しています。
Abstract
細胞ベースの治療のための主要な課題は、全身静脈内または動脈内注入後、目的の組織への高い効率での生存細胞を大量に標的とすることができないことである。従って、細胞ホーミングを増大は、現在細胞治療を改善するための戦略として検討されている。血管内皮上の細胞ローリングは、細胞ホーミングの過程における重要なステップであり、平行平板流動チャンバ（PPFC）を用いてインビトロで調べることができる。しかしながら、これは、コントロール不良のフロー条件で、非常に退屈な、低スループットアッセイである。代わりに、我々は正確に制御され、生理学的に関連するせん断流1,2の下で、より高いスループットで携帯圧延性質の研究が可能になり、マルチウェルプレートのマイクロ流体システムを使用していました。本論文では、HL-60の転がり特性（人間の前骨髄球性白血病）、P-およびE-セレクチンでコーティングされた表面上での細胞だけでなく、細胞の単層でコーティングされた表面にはreadilする方法を示しYは、検討した。良好な炎症状態をシミュレートするために、マイクロ流体チャネルの表面は、次いで、有意に動的条件下でのHL-60細胞との相互作用を増大させる、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）で活性化した内皮細胞（EC）でコーティングした。強化されたスループットと、このような速度を圧延パス圧延などのパラメータの迅速な分析を可能にする統合されたマルチパラメータ解析ソフトウェアプラットフォームは、 インビトロの細胞ローリングの特性を評価するための重要な利点である。細胞ローリングおよびホーミングに影響を与えるように設計された工学的アプローチの迅速かつ正確な分析を可能にし、このプラットフォームは、あらかじめ、外因性細胞ベースの治療を助けるかもしれない。
Introduction
細胞ベースの治療の成功臨床翻訳の主要な課題の一つは、非効率的な配信や希望のサイト3,4に全身注入された細胞の標的である。従って、細胞ホーミングを改善するためのアプローチのための一定の探索があり、具体的には細胞療法を改善するための戦略として、ローリング細胞。血管に細胞ローリングは、古典的に疾患部位5に補充される白血球のために定義され、細胞のホーミングカスケードにおける重要なステップである。このステップは、すなわち 、内皮セレクチン間の特異的相互作用によって支配されるP-およびE-セレクチン（P-およびE-SEL）、及びそれらのカウンターリガンド白血球5,6の表面に。理解と細胞のホーミング、具体的には、圧延工程の効率改善は、細胞ベースの治療を改善するための新しいプラットフォームのための探求で非常に重要である。今日まで、この2つの平らなプラットフォームを含む、パラレルプレートフローチャンバー（PPFCs）を使用することによって達成されている細胞懸濁液をシリンジポンプ7,8、9を用いて灌流されたプレートを介して上部に位置する流入および流出ポートと、それらの間にガスケットを有するエス。底板の表面は、関連する細胞単層/基材で被覆することができ、せん断流下灌流細胞と表面との間の相互作用は、その後7を検討している。しかし、PPFCは気泡形成、漏洩、および主要な欠点を提示するコントロール不良の流れと、低スループット、試薬がかかり、かなり面倒な方法です。
従来のPPFCの代替技術は、低消費1,10試薬と細胞アッセイ（PPFCsより最大10倍高い）正確な、コンピュータ制御されたせん断流の下で、より高いスループット性能を可能にする、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムである。細胞ローリング実験は、マイクロ流体チャネル内で実行されている細胞単層または操作された基材で被覆することが可能とUSIをイメージngのローリング特性を有する顕微鏡は、容易に適切なソフトウェアを用いて分析した。本研究では、異なる表面上のヒト前骨髄球性白血病（HL-60）細胞のローリングの特性を研究することによって、このマルチウェルプレート、マイクロ流体システムの能力を実証する。 HL-60 P-およびE-selの様基板上の、ならびに異なるローリング受容体を発現する細胞単層上を転動を分析した。また、ブロッキング抗体（Ab）は、それらの表面上のHL-60の回転運動を媒介する特定のセレクチンの直接的な関与を実証した。ローリング実験は、圧延速度、ローリング細胞の数、および圧延パス特性などの主要圧延パラメータの効率的な解析を可能にする、最小限の試薬/細胞消費で、安定したせん断流の下で、増大したスループットを用いて行った。
Protocol
Representative Results
Discussion
外因性の細胞ベースの治療の成功翻訳の主要な課題の一つは、効率的に、高い生着効率3で 傷害や炎症部位 に細胞を送達することができないことである。細胞ローリングは、最終的に組織5への内皮を通して、強固な接着および遊出を導く血管壁上のセルの減速を促進する、細胞のホーミングの過程における重要なステップを表している。候補セルタイプの圧延プロ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CHO-P細胞は博士バーバラ·フューリー（ベスイスラエルメディカルセンター、ハーバード大学医学部）からの親切な贈り物だった。この作品は、この作品にもJMKにMovember – 前立腺がん財団チャレンジ賞によって部分的にサポートされていましたJMKに健康グラントHL095722の国立研究所によってサポートされていました
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
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