Analisi sistematica delle<em> In Vitro</em> Cella rotolamento Utilizzando un piatto multi-ben Sistema Microfluidic
Summary
Questo studio ha utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, aumentando notevolmente la velocità di rotolamento studi cella in flusso di taglio fisiologicamente rilevanti. Data l'importanza della laminazione di cellule nella cella multi-step homing a cascata e l'importanza di homing delle cellule dopo la consegna sistematica delle popolazioni esogeni di cellule nei pazienti, questo sistema offre un potenziale come piattaforma di screening per migliorare la terapia cellulare.
Abstract
Una sfida importante per terapia cellulare è l'incapacità di indirizzare sistemicamente una grande quantità di cellule vitali con alta efficienza per tessuti di interesse dopo infusione endovenosa o intraarteriosa. Di conseguenza, l'aumento homing delle cellule è attualmente studiata come una strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella rotolamento sull'endotelio vascolare è un passo importante nel processo di homing delle cellule e può essere sondato in vitro utilizzando una camera di flusso a piatti paralleli (PPFC). Tuttavia, questo è estremamente noioso, basso dosaggio produttività, con condizioni di flusso scarsamente controllato. Invece, abbiamo utilizzato un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto che consente lo studio delle proprietà di rotolamento cellulare in un throughput più elevato sotto controllato con precisione, fisiologicamente rilevante flusso di taglio 1,2. In questo articolo, vi mostriamo come le proprietà di rotolamento di HL-60 (leucemia promielocitica umana), le cellule su superfici E-selectina-rivestite-P e così come su superfici monostrato rivestite cellulari possono essere readily esaminato. Per meglio simulare condizioni infiammatorie, la superficie canale microfluidico è stata rivestita con le cellule endoteliali (EC), che sono stati poi attivati con Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α), aumentando notevolmente le interazioni con cellule HL-60 in condizioni dinamiche. La velocità aumentata e piattaforma integrata di analisi software multi-parametro, che permette una rapida analisi di parametri quali la velocità di rotolamento e il percorso di rotolamento, sono vantaggi importanti per la valutazione delle cellule laminazione di proprietà in-vitro. Consentire l'analisi rapida e accurata di approcci di ingegneria progettato per avere un impatto rotolamento delle cellule e homing, questa piattaforma può aiutare terapia anticipo cell-based esogeno.
Introduction
Una delle sfide principali nella traduzione clinica di successo della terapia a base di cellule è la consegna inefficiente o il targeting di cellule sistemica infuse ai siti desiderati 3,4. Di conseguenza, vi è una costante ricerca di metodi per migliorare homing delle cellule, e specificamente cellula rotolamento, come strategia per migliorare la terapia cellulare. Cella a rotazione sui vasi sanguigni è un passo fondamentale nella cascata di homing delle cellule, definito classicamente per i leucociti che vengono reclutati per siti di malattia 5. Questa fase è regolata da interazioni specifiche tra selectine endoteliali, cioè-P ed E-selectina (-P e E-sel), e loro ligandi contatore sulla superficie dei leucociti 5,6. Una migliore comprensione e una migliore efficienza di homing delle cellule, e in particolare la fase di laminazione, sono di grande importanza nella ricerca di nuove piattaforme per migliorare la terapia cellulare. Fino ad oggi questo è stato ottenuto utilizzando camere di flusso piastra parallele (PPFCs), comprendente due plat piattoes con una guarnizione tra loro, con una apertura di afflusso e deflusso trova alla piastra superiore, attraverso la quale una sospensione cellulare è perfuso utilizzando una siringa pompa 7,8, 9. La superficie della piastra inferiore può essere rivestito con un monostrato di cellule competenti / substrati e l'interazione tra cellule perfusi e la superficie sotto flusso di taglio è poi esplorato 7. Tuttavia, PPFC è un volume basso, reattivo-consumo, e metodo abbastanza noioso, con formazione di bolle, perdite, e il flusso scarsamente controllato presenta gravi inconvenienti.
Una tecnica alternativa alla PPFC tradizionale è un sistema di microfluidica piastra multi-pozzetto, permettendo prestazioni più elevate velocità di analisi cellulari (fino a 10 volte superiore rispetto PPFCs) sotto flusso preciso e taglio controllato da computer, con basso consumo di reagente 1,10. Esperimenti di laminazione delle cellule vengono eseguiti all'interno dei canali microfluidica, che può essere rivestito con monostrati cellulari o substrati ingegnerizzati e USI ripresong un microscopio, con proprietà di rotolamento prontamente analizzati utilizzando un software adatto. In questo studio, abbiamo dimostrato le capacità di questo multi-well sistema di microfluidica piastra di studiare le proprietà di rotolamento di leucemia promielocitica umana (HL-60) le cellule su superfici diverse. HL-60 rotola su supporti come-P ed E-sel, nonché su monostrati di cellule che esprimono diversi recettori di rotolamento, è stato analizzato. Inoltre, l'anticorpo (Ab) di blocco è stato utilizzato per dimostrare coinvolgimento diretto di selectine specifici nel mediare il movimento di rotolamento di HL-60 su tali superfici. Esperimenti di rotolamento sono stati effettuati con maggiore velocità, sotto flusso di taglio stabile, con il minimo consumo di reagente / cellulare, che permette l'analisi efficiente dei parametri di laminazione chiave come velocità di rotazione, il numero di cellule di rotolamento, e rotolamento proprietà del percorso.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una delle sfide principali nella traduzione di successo della terapia a base di cellule esogena è l'incapacità di fornire in modo efficiente le celle a siti di lesioni e infiammazioni con alta efficienza attecchimento 3. Laminazione cella rappresenta un passo fondamentale nel processo di homing delle cellule, facilitando la decelerazione di cellule sulle pareti dei vasi sanguigni, portando infine alla loro ferma adesione e trasmigrazione attraverso l'endotelio nel tessuto 5. Una migliore …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cellule CHO-P sono stati un gentile dono del Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institute of Health di sovvenzione HL095722 a JMK Questo lavoro è stato supportato anche in parte da un Movember-Prostate Cancer Foundation Challenge Award per JMK
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
References
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