Análise sistemática de<em> In Vitro</em> Célula de rolamento usando um sistema microfluídicos Multi-bem placa
Summary
Este estudo utilizou um sistema de microfluídica multi-bem placa, aumentando significativamente o rendimento dos estudos rolantes célula sob fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante. Dada a importância da laminagem celular na célula de multi-passo homing cascata e a importância de homing celular após entrega sistémica de populações exógenas de células em pacientes, este sistema oferece a possibilidade de uma plataforma de pesquisa para melhorar a terapia de base celular.
Abstract
Um grande desafio para a terapia de base celular é a incapacidade para atingir sistemicamente uma grande quantidade de células viáveis com eficiência elevada para os tecidos de interesse após a infusão intravenosa ou intra-arterial. Consequentemente, o aumento homing celular é atualmente estudada como uma estratégia para melhorar a terapia celular. Célula de rolamento sobre o endotélio vascular é um passo importante no processo de homing célula e podem ser sondados in vitro utilizando uma câmara de fluxo de placas paralelas (PPFC). No entanto, este é um ensaio de transferência extremamente fastidioso, de baixo, com as condições de fluxo mal controlada. Em vez disso, foi utilizado um sistema de microfluídica multi-bem placa que permite estudo das propriedades de rolamento celular em um maior rendimento sob precisamente controlado, fluxo de cisalhamento fisiologicamente relevante 1,2. Neste artigo, vamos mostrar como as propriedades de rolamento do HL-60 (leucemia promielocítica humana) células em superfícies E-revestido-selectina P-e, assim como em superfícies revestidas de monocamada de células pode ser readily examinada. Para melhor simular as condições inflamatórias, a superfície do canal microfluídico foi revestida com células endoteliais (ECs), que foram, em seguida, activados com fator de necrose tumoral-α (TNF-α), aumentando significativamente as interacções com células HL-60 em condições dinâmicas. A taxa de transferência melhorada e multi-parâmetro plataforma de análise de software integrado, que permite a rápida análise de parâmetros como rolando velocidades e caminho de rolamento, são vantagens importantes para avaliar as propriedades da célula rolando in-vitro. Permitindo a análise rápida e precisa de abordagens de engenharia destinados a impactar rolamento celular e homing, esta plataforma pode ajudar a terapia baseada em células exógena antecedência.
Introduction
Um dos principais desafios na tradução clínica de sucesso da terapia baseada em células é a entrega ineficiente ou direcionamento de células sistemicamente infundidos aos locais desejados 3,4. Consequentemente, há uma busca constante de abordagens para melhorar homing celular e, especificamente, celular rolando, como uma estratégia para melhorar a terapia celular. Celular rolando sobre os vasos sanguíneos é um passo fundamental na cascata homing célula, classicamente definidos para leucócitos que são recrutados para sítios da doença 5. Este passo é governado por interacções específicas entre selectinas endoteliais, isto é, P-e E-selectina seus ligantes de contador na superfície de leucócitos 5,6 (P-e E-sel), e. Para uma melhor compreensão e melhoria da eficiência de homing celular e, especificamente, a etapa de rolamento, são de grande importância na busca de novas plataformas para melhorar a terapia baseada em células. Até agora isso tem sido conseguido através de câmaras de fluxo de placas paralelas (PPFCs), compreendendo dois plataforma planaes com uma junta entre eles, com uma porta de entrada e saída localizada sobre a placa superior, através da qual uma suspensão de células é perfundido através da utilização de uma bomba de seringa, 7,8, 9. A superfície da placa de fundo pode ser revestida com uma monocamada de células / substratos relevantes e a interacção entre as células e a superfície perfundidos sob fluxo de cisalhamento é então explorado 7. No entanto, PPFC é uma baixa, reagente-consuming, e método bastante tedioso, com formação de bolhas, vazamento e refluxo mal controlada apresentando grandes inconvenientes.
Uma técnica alternativa para o PPFC tradicional é um sistema de microfluídica placa multi-bem, o que permite maior desempenho de transferência de ensaios celulares (até 10 vezes maior do que PPFCs) sob, o fluxo de cisalhamento controlado por computador precisa, com baixo consumo de reagente 1,10. Experiências de rolamento celular são realizados no interior dos canais de microfluidos, que pode ser revestido com as monocamadas de células ou substratos modificados e usi fotografadang de um microscópio, com propriedades de rolamento facilmente analisados utilizando um software adequado. Neste estudo, demonstramos a capacidade deste sistema de microfluídica placa multi-bem, estudando as propriedades de rolamento de leucemia promielocítica humana (HL-60) células em diferentes superfícies. HL-60 de rolamento em substratos como a P-e E-sel, bem como sobre monocamadas de células que expressam diferentes receptores de rolamento, foi analisado. Além disso, o anticorpo (Ab) bloqueio foi usado para demonstrar o envolvimento directo de selectinas específicas na mediação do movimento de rolamento de células HL-60 sobre essas superfícies. Experimentos rolamento foram realizados com maior produção, sob fluxo de cisalhamento estável, com o mínimo consumo de reagente / celular, permitindo a análise eficiente dos parâmetros-chave do rolamento tais como a velocidade de rolamento, o número de células de rolamento, e rolando propriedades do caminho.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um dos grandes desafios na tradução bem sucedida de terapia baseada em células exógena é a incapacidade de produzir com eficiência células para locais de lesão e inflamação com alta eficiência de enxerto 3. Laminagem celular representa um passo crítico no processo de homing célula, facilitando a desaceleração de células nas paredes de vasos sanguíneos, o que levou à sua adesão firme e transmigração através do endotélio para os tecidos 5. Para uma melhor compreensão do proces…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Células CHO-P foram um presente amável do Dr. Barbara Furie (Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School). Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Saúde HL095722 concessão para JMK Este trabalho também foi apoiado em parte por um Movember-Prostate Cancer Foundation Prêmio Desafio para JMK
Materials
| Cells | |||
| Human Lung Microvascular Endothelial Cells | Lonza | CC-2527 | |
| P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) | Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12 | ||
| HL-60 Cells | ATCC | CCL-240 | |
| [header] | |||
| Cell Culture Reagents | |||
| Endothelial Basal Medium | Lonza | CC-3156 | |
| EBM-2 Media | Lonza | CC-3156 | |
| Endothelial Basal Medium Supplements | Lonza | CC-4147 | |
| EGM-2 MV SingleQuots | Lonza | CC-4147 | |
| IMDM – Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x | Gibco | 12440 | |
| F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) | Gibco | 11765-054 | |
| Penicillin Streptomycin (P/S) | Gibco | 15140 | |
| L-Glutamine (L/G) 200 mM | Gibco | 25030 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | Sa550 | |
| Petri Dishes | BD Falcon | BD-353003 | |
| 100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene | |||
| Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) | MedSupply Partners | TC1500 | |
| T75 Flasks | BD Falcon | 353136 | |
| Gelatin Solution (2%) | Sigma | G1393 | |
| dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) | Sigma | D8537 | |
| Trypsin-EDTA Solution (10x) | Sigma | T4174 | |
| [header] | |||
| Antibodies | |||
| Anti-hE-Selectin/CD62E | R&D Systems | BBA21 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA21 | |
| Anti-hP-Selectin | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Conjugated Mouse IgG1 | R&D Systems | BBA34 | |
| FITC Mouse IgG1 κ Isotype Control | BD Bioscience | 555748 | |
| Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 | Santa Cruz | SC70545 | |
| FITC Conjugated | Santa Cruz | SC70545 | |
| Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control | Santa Cruz | SC2859 | |
| PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 | BD Pharmingen | 556055 | |
| PE Mouse IgG1 k Isotype Control | BD Pharmingen | 550617 | |
| Anti-P-Selectin Ab (AK4) | Santa Cruz | SC19996 | |
| Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 | Millipore | MAB2150 | |
| Mouse IgG1 Isotype Control | Santa Cruz | SC3877 | |
| [header] | |||
| Other Reagents | |||
| Recombinant Human TNF-alpha | PeproTech | 300-01A | |
| Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit – For Flow Cytometry | Invitrogen | C34554 | |
| Human P-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 137-PS-050 | |
| Human E-selectin-FC recombinant protein | R&D Systems | 724-ES-100 | |
| Fibronectin Human, Plasma | Invitrogen | 33016-015 | |
| [header] | |||
| Equipment | |||
| Bioflux 1000 | Fluxion Biosciences | Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| BioFlux 48-well plates | Fluxion Biosciences | ||
| BD Accuri C6 Flow Cytometer | BD Bioscience | CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data | |
| Nikon Eclipse Ti-S | Nikon | ||
| CoolSnap HQ2 CCD camera | Photometrics |
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