細胞培養およびひよこ胚における軸索誘導受容体のダイナミクス評価におけるpHluorinの使用
Summary
ここでは、pH感受性緑色蛍光タンパク質変異体pHluorinを用いて、細胞表面における軸索誘導受容体の密売の時空間的ダイナミクスを研究する。pHluorinタグ付き受容体は、細胞培養と 生体内の両方で発現し、ひよこ胚のエレクトロポレーションを用いる。
Abstract
開発中、軸索誘導受容体は、魅力的で反発的な手がかりの両方に対する軸索感度を調節する上で重要な役割を果たす。実際に、ガイダンス受容体の活性化は、軸索先端、成長コーン、リガンドに応答することを可能にするシグナル伝達機構の第一段階である。したがって、細胞表面でのそれらの可用性の変調は、成長コーン感度の設定に関与するメカニズムの一つである。ここでは、発達中のひよこ脊髄におけるインビトロおよびインビボの両方の軸索誘導受容体の時空間的細胞表面ダイナミクスを正確に可視化する方法について述べている。緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体のpH依存性蛍光性を利用して、細胞膜に取り組む軸索誘導受容体の割合を特異的に検出しました。我々は、まず、このようなpH依存性構造のインビトロ検証を記述し、さらに、関心のある軸索誘導受容体の時空間的ダイナミクスを評価するために、ひよこ脊髄における生体内でのそれらの使用をさらに詳述する。
Introduction
彼らのナビゲーション中に、軸索は彼らの目標に向かってそれらを導く複数の環境の手がかりを統合する。これらの手がかりは、軸索末端の表面で誘導受容体を活性化し、成長コーンは、今度は適切なシグナル伝達経路を開始する。したがって、受容体の細胞表面分布の時間的および空間的調節は、成長コーン1の感度を設定するために重要である。この文脈では、コミシャル軸索による正中線交差は、受容体細胞表面レベルの調節を調査するための優れたモデルである。発達中の脊髄では、コミシャル軸索は当初、正中線を横切る腹側床板に向かって引き付けられる。交差した後、床板の誘引物質への応答性を失い、床板を出て神経系2,3の反対側の最終目的地に向かってナビゲートできるように、床板忌避剤に対する応答を得る。成長コーン表面における受容体の利用可能性の調節は、正中のキューへの応答性の切り替えの基礎となるメカニズムの1つである 4,5.したがって、成長コーンの原形質膜に存在する受容体の選択的モニタリングが最も重要である。ここでは、現像するひよこ脊髄において、 生体外 および 生体内で血漿膜に対処される軸索誘導受容体を特異的に可視化する緑色蛍光タンパク質(GFP)変異体のpH依存性蛍光性に基づく方法について説明する。
Rothmanたちの研究グループは、ecliptic pHluorin6を含むGFPのpH感受性変異をポイント変異によって設計した。エクリプティックpHluorinは、中性pHで蛍光されながら酸性pH(<6)に曝露されると非蛍光であるという性質を有する。これにより、細胞内酸性コンパートメントに局在する非蛍光受容体(すなわち、内生小胞)を、細胞膜に取り込まれ、細胞外中性pH7に曝露される蛍光受容体から区別することができる。これを利用して、プレキシンA1の細胞膜局在を監視し、正中忌避セマフォリン3B5 に対する成長コーン応答を媒介する軸索誘導受容体である(図1A)。ここでは、pHluorin-plexinA1コンストラクトの インビトロ 特徴付けについて、発達中のひよこ脊髄におけるこの構造の ovo エレクトロポレーション8-10 と共に、空間および時間的解像度 の両方で生体内 の軸索誘導受容体ダイナミクスに従うことを可能にする極低温分析を行う。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、細胞培養およびひよこ胚脊髄の発達コンテキストの両方において軸索誘導受容体のダイナミクスに従うステップバイステップの手順を提供する。
デノボpHluorin タグ付きタンパク質を設計するには、クローニング戦略に関して2つの点を考慮する必要があります。まず、pHluorinタグは、酸性のエンドーソームの内腔に曝され、その結果、細胞膜受?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ホマイラ・ナワビ、フレデリック・モレット、イザベル・サニャスの助けに感謝します。この研究はCNRS、アソシエーション・フランセーズ・コントル・レ・ミオパシー(AFM)、ANRヤドル、ラベックス・デヴェーカン、ラベック・コルテックス、ERC YODAからV.C.;C.D-BとA.Jは、それぞれラ・リーグ・コントル・ル・ガンとラベックス・DevWeCanフェローシップによってサポートされています。
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
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