Использование рГлуорин для оценки динамики аксонов Руководящие рецепторы в клеточной культуре и в Чик эмбриона
Summary
Мы описываем здесь использование рН чувствительных зеленый флуоресцентный вариант белка, pHluorin, для изучения пространственно-временной динамики аксоновых рецепторов руководства торговли на поверхности клетки. Рецептор с тегами рГлуорина выражается как в клеточной культуре, так и в in vivo,с использованием электропорации эмбриона птенца.
Abstract
Во время разработки рецепторы аксонового наведения играют решающую роль в регулировании чувствительности аксонов как к привлекательным, так и к отталкивающим сигналам. Действительно, активация рецепторов наведения является первым шагом сигнальных механизмов, позволяющих аксоновые наконечники, конусы роста, реагировать на лиганды. Таким образом, модуляция их наличия на поверхности клетки является одним из механизмов, которые участвуют в установлении чувствительности конуса роста. Мы описываем здесь метод точно визуализировать пространственно-височной динамики поверхности клеток аксонового рецептора как in vitro, так и in vivo в развивающемся спинном мозге птенца. Мы воспользовались рН-зависимой флуоресценции собственности зеленого флуоресцентного белка (GFP) вариант специально обнаружить долю аксонового рецептора руководства, который адресован плазменной мембраны. Сначала мы описываем in vitro проверки таких рН-зависимых конструкций, и мы более подробно их использование in vivo, в цыпленок спинного аккорда, для оценки пространственно-временной динамики аксон руководство рецептор интереса.
Introduction
Во время навигации аксоны интегрируют несколько экологических сигналов, которые направляют их к цели. Эти сигналы активируют наведение рецепторов на поверхности аксоновых терминалов, конусов роста, которые, в свою очередь, инициируют соответствующий сигнальный путь. Таким образом, височное и пространственное регулирование распределения поверхности клеток рецепторов имеет решающее значение для установить чувствительность конуса роста1. В этом контексте, средней линии пересечения комиссариальных аксонов является отличной моделью для исследования регулирования уровней поверхности рецепторов клеток. В развивающемся спинном мозге, комиссаральные аксоны первоначально привлекают к брюшной пластины пола, где они пересекают средней линии. После пересечения, они теряют свою отзывчивость на пол пластины притягания и получить ответ на пол пластины репелленты, чтобы они могли выйти из пола пластины и перейти к их конечного пункта назначения в контралатеральной стороненервной системы 2,3. Регулирование доступности рецепторов на поверхности конуса роста является одним из механизмов, лежащих в основе переключения отзывчивости на сигналы среднейлинии 4,5. Таким образом, избирательный мониторинг рецепторов, присутствующих на плазменной мембране конусов роста, имеет первостепенное значение. Мы описываем здесь метод, основанный на рН-зависимых флуоресценции собственности зеленого флуоресцентного белка (GFP) вариант специально визуализировать аксон наведения рецепторов, которые адресованы плазменной мембраны in vitro и in vivo, в развивающихся цыпленок спинного мозга.
Ротман и его коллеги, разработанные точечными мутациями рН-чувствительных вариантов GFP, включая эклиптический рГлуорин6. Эклиптический рГлуорин имеет свойство быть нефлуоресцентным при воздействии кислого рН (<6), будучи флуоресцентным при нейтральном рН. Это позволяет отличить нефлуоресцентные рецепторы, локализованные во внутриклеточных кислых отсеках(т.е. эндосомы, оборот пузырьков) от флуоресцентных рецепторов, включенных в плазменную мембрану и, таким образом, подверженных внеклеточному нейтральномурН 7. Мы воспользовались этим для мониторинга локализации плазменной мембраны plexinA1, рецептора наведения аксона, окаймлив реакцию конуса роста на реакцию среднего репеллента семафорина 3B5 (Рисунок 1A). Мы описываем здесь in vitro характеристику конструкции pHluorin-plexinA1, вместе с в электропорации ово 8-10 этой конструкции в развивающемся спинном мозге цыпленка последованной за микроскопическим анализом cryosections которые позволяют последовать за динамикой рецептора наведения аксона in vivo с и пространственными и височные разрешения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол обеспечивает пошаговую процедуру, чтобы следить за динамикой рецептора руководства аксона как в клеточной культуре, так и в контексте развития спинного мозга эмбриона цыпленка.
Для разработки белка с тегами de novo pHluorin необходимо учитывать две точки от?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Хомайру Наваби, Фредерика Море и Изабель Саньяс за помощь. Эта работа поддерживается CNRS, Ассоциация Франсез contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA В.C.; C.D-B и A.J поддерживаются стипендиями La Ligue contre le cancer и Labex DevWeCan, соответственно.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
