Användning av pHluorin för att bedöma dynamiken hos Axon Guidance Receptors i cellkulturen och i kycklingembryon
Summary
Vi beskriver här användningen av en pH-känsliga gröna fluorescerande protein variant, pHluorin, att studera spatio-temporal dynamiken i axon vägledning receptorer handel vid cell ytan. Den pHluorin-märkta receptorn uttrycks både i cellkultur och in vivo, med hjälp av elektroporering av kycklingembryon.
Abstract
Under utvecklingen spelar axon guidance receptorer en avgörande roll för att reglera axons känslighet för både attraktiva och motbjudande signaler. Aktivering av vägledningsreceptorerna är faktiskt det första steget i signalmekanismerna som gör det möjligt för axonspetsar, tillväxtkonerna, att svara på liganderna. Som sådan är modulering av deras tillgänglighet vid cellytan en av de mekanismer som deltar i att ställa in tillväxtkonkänsligheten. Vi beskriver här en metod för att exakt visualisera spatio-temporal cell ytan dynamiken i en axon vägledning receptor både in vitro och in vivo i den utvecklande chick ryggmärgen. Vi utnyttjade den pH-beroende fluorescensegenskapen hos en grön fluorescerande proteinvariant (GFP) för att specifikt upptäcka den del av axonvägledningsreceptorn som är adresserad till plasmamembranet. Vi beskriver först in vitro-valideringen av sådana pH-beroende konstruktioner och vi beskriver vidare deras användning in vivo, i kyckling spinal ackord, för att bedöma spatio-temporal dynamiken i axon vägledning receptorn av intresse.
Introduction
Under navigeringen integrerar axoner flera miljösignaler som vägleder dem mot sitt mål. Dessa signaler aktiverar styrreceptorer vid axonterminalernas yta, tillväxtkonerna, som i sin tur initierar en lämplig signalväg. Således är den tidsmässiga och rumsliga regleringen av receptorernas cellytafördelning avgörande för att ställa in känsligheten hos tillväxtkonen1. I detta sammanhang är midline korsning av commissural axons en utmärkt modell för att undersöka regleringen av receptor cell ytnivåer. I den utvecklande ryggmärgen lockas commissural axons initialt mot ventrala golvplattan där de korsar mittlinjen. Efter korsning förlorar de sin lyhördhet till golvplattans attractants och får svar på golvplåtsavstötningar så att de kan lämna golvplattan och navigera mot sin slutdestination i nervsystemets kontralaterala sida2,3. Reglering av receptortillgänglighet vid tillväxtkonytan är en av de mekanismer som ligger till grund för bytet av responsivitet till mellanlinjesignaler4,5. Således är selektiv övervakning av de receptorer som finns vid plasmamembranet av tillväxtkoner av största vikt. Vi beskriver här en metod baserad på den pH-beroende fluorescensegenskapen hos en grön fluorescerande protein (GFP) variant för att specifikt visualisera axon vägledning receptorer som är adresserade till plasmamembran in vitro och in vivo, i den utvecklande kyckling ryggmärgen.
Rothman och kollegor konstruerade av punktmutationer pH-känsliga varianter av GFP inklusive förmörkelse pHluorin6. Ekliptisk pHluorin har egenskapen att vara icke-fluorescerande när den utsätts för surt pH (<6), samtidigt som det fluorescerande vid neutralt pH. Detta gör det möjligt att skilja icke-fluorescerande receptorer lokaliserade i intracellulära sura fack(dvs. endosomer, trafficking vesiklar) från fluorescerande receptorer som ingår i plasmamembranet och därmed utsätts för det extracellulära neutrala pH7. Vi utnyttjade detta för att övervaka plasmamembranlokaliseringen av plexinA1, en axon guidance receptor medla tillväxt kon svar på mittlinjen repellent semaphorin 3B5 (Figur 1A). Vi beskriver här in vitro karakterisering av en pHluorin-plexinA1 konstruktion, tillsammans med in ovo elektroporation8-10 av denna konstruktion i den utvecklande kyckling ryggmärg följt av mikroskopisk analys av cryosections som gör det möjligt att följa axon vägledning receptor dynamik in vivo med både rumsliga och tidsmässiga upplösningar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll ger ett steg-för-steg förfarande för att följa dynamiken i en axon vägledning receptor både i cell kultur och i utvecklingsmässiga sammanhang av kyckling embryo ryggmärg.
För att utforma ett de novo pHluorin-märkt protein måste två punkter beaktas när det gäller kloningsstrategin. För det första bör pHluorin-taggen utsättas för lumen i de sura endosomerna, och följaktligen för det extracellulära facket för att visualisera plasmamembranreceptorpoo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Homaira Nawabi, Frederic Moret och Isabelle Sanyas för deras hjälp. Detta arbete stöds av CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA till V.C.; C.D-B och A.J stöds av en La Ligue contre le cancer respektive Labex DevWeCan stipendier.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
References
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Biochemistry. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
