High-throughput Flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af antistoffer til N-methyl-D-aspartat-receptor eller dopamin-2-receptoren i humant serum
Summary
I de senere år har levende cellebaserede assays med held blevet anvendt til påvisning af antistoffer mod overflade og konformationelle antigener. Her beskriver vi en fremgangsmåde, ved hjælp af høj-throughput flowcytometri muliggør analyse af store grupper af patienter. Påvisning af nye antistoffer vil forbedre diagnosticering og behandling af immun-medierede sygdomme.
Abstract
I de senere år har antistoffer mod overflade og konformationelle proteiner involveret i neurotransmission blevet detekteret i autoimmune CNS-sygdomme hos børn og voksne. Disse antistoffer er blevet benyttet til at lede diagnose og behandling. Cellebaserede assays har forbedret påvisning af antistoffer i patientens serum. De er baseret på overflade-ekspression i hjernen antigener på eukaryote celler, som derefter inkuberes med fortyndet patientsera efterfulgt af fluorochrom-konjugerede sekundære antistoffer. Efter vask sekundært antistof binder derefter analyseret ved flowcytometri. Vores gruppe har udviklet et high-throughput flowcytometri levende celle-baserede assay til pålideligt antistoffer mod specifikke neurotransmitterreceptorer. Denne flowcytometri fremgangsmåde er ligetil, kvantitativ, effektiv og anvendelse af en high-throughput sampler system giver mulighed for store patientkohorter at være let analyseres på kort tid. Derudover denne celle-baseredesiger, kan let tilpasses til påvisning af antistoffer mod mange forskellige antigene mål, både fra centralnervesystemet og periferien. Opdage yderligere roman antistof biomarkører vil muliggøre hurtig og præcis diagnose og forbedre behandlingen af immun-medierede sygdomme.
Introduction
Over de senere år har autoimmune former for sygdomme i centralnervesystemet (CNS) sygdomme blevet identificeret. Det er blevet vist, at disse sygdomme er forbundet og defineret ved tilstedeværelsen af autoantistoffer. Disse antistoffer binder til neuronale receptorer eller synaptiske proteiner involveret i neurotransmission 1,2. Er blevet opdaget forskellige antigener, såsom N-methyl-D-aspartat-receptor (NMDAR) 3-5, γ-aminosmørsyre B receptor (GABAB) receptor 6, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolpropionsyre (AMPA)-receptor 7 spændingsstyret kaliumkanal (VGKC) associerede proteiner: leucin-rige gliom-aktiverede 1 protein (LGL-1) og contactin-associeret protein 2 (capsr2) 8,9, glutamatreceptor 5,10 og dopamin-2-receptor (D2R) 11. I fortiden, disse autoimmune CNS sygdomme (hovedsagelig kaldet encephalitis) var ofte udiagnosticeret og ubehandlet. Disse nye antistof biomarkører, fxNMDAR antistof eller D2R antistof, væsentligt har forbedret diagnose og bevidsthed, og har åbnet behandlingsmuligheder for patienterne. Faktisk er tidlig behandling med immunterapi er forbundet med forbedret resultat 11,12.
Traditionelle metoder til påvisning af antistoffer, såsom enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA) og Western blot er blevet anvendt til påvisning af antistoffer i sera. Men de ikke umiddelbart muliggøre anerkendelse af ekstracellulære eller overfladeepitoper og snarere kan afsløre immunoreaktivitet mod en intracellulær epitop. Antistoffer, som binder til det ekstracellulære domæne af vigtige proteiner involveret i neurotransmission sandsynligvis være patogene 2,3,7,13,14. Derfor er udviklingen af præcise og følsomme assays til at opdage relevante celleoverfladen eller ekstracellulære antistof mål i patienter er altafgørende. Guldstandarden metode i feltet er baseret på brug af levende celler, i såkaldt "celle-baSED assays ". Denne fremgangsmåde involverer ekspressionen af et antigen på overfladen af pattedyrceller (oftest humane embryonale nyre 293 (HEK293) celler) i sin native form ved transfektion af vektorer indeholdende den komplette cDNA-sekvens for antigenet af interesse. Levende nonpermeabilized celler inkuberes derefter med fortyndet patientserum og efterfølges af fluorokrom-konjugeret anti-humant immunglobulin (Ig) sekundært antistof. Intensiteten eller niveauet af fluorescens påvises derefter, og er knyttet til niveauet af autoantistof binding. Denne teknik er specifik, da kun et antigen overudtrykkes i celler. Den mest udbredte "read-out" har været konfokal mikroskopi analyse efter immuncytokemisk 4,5,8-10. Men flowcytometri cellebaserede assays er blevet anvendt med succes til påvisning af antistoffer hos patienter med demyeliniserende 15-17. Især Waters et al. 15. sammenlignet påvisning af antistof ved hjælp af en grydeel af antistof detektionsteknikker, herunder celle-baserede assays efterfulgt af mikroskopi eller flowcytometri analyser og har vist flowcytometri cellebaserede analyse at være den mest følsomme, nøjagtig og pålidelig metode. Derfor flowcytometri cellebaserede analyse er fordelagtig, da det er kvantitativ, ikke investigator-afhængige, og ikke indebærer nogen anvendelse af radioaktivt materiale. Det er også praktisk, da det giver store patientkohorter der skal analyseres i en kort tid.
For nylig har vi optimeret en high-throughput flowcytometri cellebaseret assay til påvisning NMDAR antistof og D2R antistof hos patienter med autoimmune sygdomme i centralnervesystemet 11. Vores gruppe nylig opdaget NMDAR antistof i patientens sera hjælp flowcytometri cellebaserede assay. Disse NMDAR antistof-positive sera tidligere analyseret ved hjælp af konfokal mikroskopi og den fandtes også at være positiv 11. Denne protokol beskrives en flowcytometri cellebaseret assay til påvisning af conformation-sensitive CNS antistof i patientens serum ved anvendelse af en automatiseret høj-throughput sampler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dette papir beskriver en hidtil ukendt anvendelse af flowcytometri levende cellebaseret assay til påvisning af antistoffer rettet mod specifikke celleoverflade neuronale proteiner ved anvendelse af en high-throughput sampler. Ved at bruge denne teknik, rapporterer vi, at en undergruppe af patienter, der lider med autoimmune CNS-sygdomme har serumantistoffer til overflade NMDAR eller til overfladen D2R.
Væsentlige skridt til optimal antistofpåvisning ved hjælp af denne high-throughput flo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af den australske National Sundhed og Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australien), Tourettes syndrom Association (USA), The Trish multipel sklerose Research Foundation og multipel sklerose Research Australien, Petre Foundation (Australien), Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australien). Vi takker alle de patienter og familiemedlemmer, der leveres prøver for vores undersøgelse.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
