High-throughput flowcytometrie-Cell gebaseerde test voor opsporing van antilichamen tegen N-methyl-D-aspartaat receptor of dopamine-2 receptor in het menselijk serum
Summary
In de afgelopen jaren zijn levende celgebaseerde proeven met succes gebruikt om antilichamen tegen oppervlak en conformationele antigenen. Hier beschrijven we een werkwijze met hoge doorvoer flowcytometrie waardoor de analyse van grote patiëntencohorten. Detectie van nieuwe antilichamen verbetert diagnose en behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.
Abstract
De afgelopen jaren hebben antilichamen tegen oppervlak en conformationele proteïnen betrokken bij neurotransmissie waargenomen bij auto CNS aandoeningen bij kinderen en volwassenen. Deze antilichamen zijn gebruikt om te leiden diagnose en behandeling. Cel-gebaseerde testen hebben de detectie van antilichamen in het serum patiënt verbeterd. Ze zijn gebaseerd op de oppervlakte expressie van hersenantigenen op eukaryotische cellen, die vervolgens geïncubeerd met verdunde sera gevolgd door fluorochroom-geconjugeerde secundaire antilichamen. Na wassen wordt voortgezet antilichaambinding vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. Onze groep heeft een high-throughput flowcytometrie levende cellen gebaseerde test ontwikkeld om betrouwbaar te detecteren antilichamen tegen specifieke neurotransmitter receptoren. Deze stroom cytometrie methode is eenvoudig, kwantitatief, efficiënt en het gebruik van een high-throughput sampler systeem maakt grote patientencohorten gemakkelijk worden getest in een korte tijd. Bovendien, deze cel-gebaseerde alszegt kan gemakkelijk worden aangepast aan antilichamen vele verschillende antigene doelen, zowel het centrale zenuwstelsel en de periferie. Het ontdekken van extra nieuwe afweerstoffen zal een snelle en nauwkeurige diagnose mogelijk te maken en het verbeteren van de behandeling van immuun-gemedieerde aandoeningen.
Introduction
In de afgelopen jaren hebben auto-vormen van het centrale zenuwstelsel (CNS) ziekten geïdentificeerd. Aangetoond is dat deze ziekten geassocieerd zijn gedefinieerd door de aanwezigheid van autoantilichamen. Deze antilichamen binden aan receptoren neuronale en synaptische proteïnen betrokken bij neurotransmissie 1,2. Verschillende antigenen werden gedetecteerd, zoals N-methyl-D-aspartaat receptor (NMDAR) 3-5, γ-aminoboterzuur B receptor (GABA B) receptor 6, α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic zuur (AMPA) receptor 7, voltage-gated kalium kanaal (VGKC) geassocieerde eiwitten: leucine-rich-glioom geactiveerd 1 eiwit (LGL-1) en-contactine geassocieerd proteïne 2 (capsr2) 8,9, glutamaat receptor 5,10 en dopamine-2-receptor (D2R) 11. In het verleden zijn deze auto in het centraal zenuwstelsel (vooral genoemd encefalitis) waren vaak niet gediagnosticeerd en onbehandeld. Deze nieuwe afweerstoffen, bijv.NMDAR antilichaam of D2R antilichaam, zijn aanzienlijk verbeterd diagnose en bewustzijn, en hebben behandelingsopties voor patiënten geopend. Inderdaad, is vroege behandeling met immuuntherapie geassocieerd met een verbeterde uitkomst 11,12.
Traditionele methoden om antilichamen, zoals enzym-gebonden immunosorbent assay (ELISA) en Western blot detectie zijn gebruikt voor de detectie van antilichamen in sera. Echter, ze niet gemakkelijk in staat de erkenning van extracellulaire of oppervlakte-epitopen en, in plaats daarvan kan immunoreactiviteit naar een intracellulaire epitoop onthullen. Bovendien antilichamen die binden aan het extracellulaire domein van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij neurotransmissie waarschijnlijk pathogeen 2,3,7,13,14 zijn. Daarom is de ontwikkeling van nauwkeurige en gevoelige assays om relevante celoppervlak of extracellulaire targets voor antilichamen bij patiënten ontdekken staat voorop. De gouden standaard methode het gebied is gebaseerd op het gebruik van levende cellen in de zogenaamde "cel-based assays ". Deze werkwijze omvat de expressie van een antigeen op het oppervlak van zoogdiercellen (meest humane embryonische nier 293 (HEK293) cellen) in zijn natieve vorm door transfectie van vectoren die de volledige cDNA-sequentie van het antigeen van belang. Nonpermeabilized levende cellen worden vervolgens geïncubeerd met verdund patiënt serum en vervolgens fluorochroom-geconjugeerde anti-humaan immunoglobuline (Ig) secundair antilichaam. De intensiteit of het niveau van fluorescentie wordt vervolgens gedetecteerd en is gekoppeld aan het niveau van auto-antilichaam binding. Deze techniek is specifiek, aangezien slechts een antigeen tot overexpressie wordt gebracht in cellen. De meest gebruikte "read-out" heeft confocale microscopie analyse geweest na immunocytochemie 4,5,8-10. Echter, flowcytometrie celgebaseerde proeven zijn met succes gebruikt om antilichamen te detecteren bij patiënten met demyelineringsziekten 15-17. Vooral Waters et al.. 15 vergeleek de opsporing van antilichamen met een panel antilichaam detectietechnieken zoals celgebaseerde proeven gevolgd door microscopie of flowcytometrie geanalyseerd en blijkt flowcytometrie celgebaseerde analyse de meest gevoelige, nauwkeurige en betrouwbare methode. Daarom flowcytometrie celgebaseerde analyse is voordelig omdat het kwantitatief, niet onderzoeker afhankelijk, en het gebruik van radioactieve stoffen geen sprake. Het is ook handig omdat hiermee grote patientencohorten worden getest in een korte tijd.
Meer recent hebben wij een high-throughput doorstroomcytometrie celgebaseerde assay NMDAR antilichaam en D2R opsporing van antilichamen bij patiënten met auto centrale zenuwstelsel 11 geoptimaliseerd. Heeft onze groep recent ontdekt NMDAR antilichaam in sera van patiënten met behulp van flowcytometrie-cel-gebaseerde test. Deze NMDAR antilichaam-positieve sera waren eerder geanalyseerd met confocale microscopie en bleken ook positief te zijn 11. Dit protocol beschrijft een doorstroomcytometrie-cellen gebaseerde assay voor de detectie van conformation-gevoelige CNS antilichaam in serum van de patiënt met behulp van een geautomatiseerde high-throughput sampler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit document beschrijft een nieuwe toepassing van flowcytometrie levende cellen gebaseerde test om antilichamen gericht op specifieke celoppervlak neuronale eiwitten met behulp van een high-throughput sampler detecteren. Met behulp van deze techniek, we melden dat een subgroep van patiënten die lijden met auto CNS ziekten hebben serum antilichamen tegen NMDAR oppervlak of aan de oppervlakte D2R.
Essentiële stappen voor optimale detectie-antilichaam met deze high-throughput doorstroomcytome…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Australische National Health en Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australië), Gilles de la Tourette syndroom Association (USA), De Trish Multiple Sclerose Research Foundation en Multiple Sclerose Research Australië, Petre Foundation (Australië), de Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australië). Wij danken alle patiënten en familieleden die monsters voor onze studie verstrekt.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
