High-throughput Flödescytometri cellbaserad analys för att detektera antikroppar till N-metyl-D-aspartat-receptor-eller dopamin-2-receptor i humant serum
Summary
Under de senaste åren har levande cellbaserade analyser använts framgångsrikt för att påvisa antikroppar mot ytan och konforma antigener. Här beskriver vi en metod som använder hög genomströmning flödescytometri möjliggör analys av stora grupper av patienter. Upptäckt av nya antikroppar kommer att förbättra diagnos och behandling av immunmedierade sjukdomar.
Abstract
Under de senaste åren har antikroppar mot ytan och konforma proteiner involverade i neurotransmission upptäckts i autoimmuna CNS-sjukdomar hos barn och vuxna. Dessa antikroppar har använts för att vägleda diagnos och behandling. Cellbaserade analyser har förbättrad detektion av antikroppar i patientserum. De är baserade på ytexpressionen av hjärn antigener på eukaryota celler, som sedan inkuberades med utspätt patientserum följt av fluorokromkonjugerade sekundära antikroppar. Efter tvättning sekundär antikropp-bindning analyserades sedan genom flödescytometri. Vår grupp har utvecklat en hög genomströmning flödescytometri levande cellbaserad analys för att tillförlitligt påvisa antikroppar mot specifika neurotransmittorreceptorer. Denna flödescytometri metod är rakt fram, kvantitativt, effektiv, och användningen av en hög genomströmning provtagaren systemet tillåter för stora patientgrupper för att lätt analyseras på en kort tid. Dessutom, denna cellbaserade somsäger kan enkelt anpassas för att påvisa antikroppar mot flera olika antigena mål, både från det centrala nervsystemet och periferin. Upptäcka ytterligare biomarkörer roman antikropps möjliggör snabb och korrekt diagnos och förbättra behandlingen av immunmedierade sjukdomar.
Introduction
Under de senaste åren har autoimmuna former av centrala nervsystemet (CNS) sjukdomar identifierats. Det har visats att dessa sjukdomar är associerade och definieras av närvaron av autoantikroppar. Dessa antikroppar binder till neuronala receptorer eller synaptiska proteiner involverade i neurotransmission 1,2. Olika antigener har detekterats, såsom N-metyl-D-aspartat-receptorn (NMDAR) 3-5, γ-aminosmörsyra B-receptorn (GABA-B)-receptor 6, α-amino-3-hydroxi-5-metyl-4- isoxazolpropionsyra (AMPA)-receptorn 7, spänningskänsliga kaliumkanal (VGKC) associerade proteiner: leucin-rika gliom aktiverad ett protein (LGL-1) och contactin-associerat protein 2 (capsr2) 8,9, glutamatreceptor 5,10 och dopamin-2-receptor (D2R) 11. Förr i tiden, dessa autoimmuna sjukdomar i centrala nervsystemet (främst kallade hjärninflammation) var ofta odiagnostiserade och obehandlade. Dessa nya biomarkörer antikroppar, t.ex.NMDAR antikropp eller D2R antikropp, har avsevärt förbättrats diagnos och medvetenhet, och har öppnat behandlingsalternativ för patienter. Faktum är tidig behandling med immunterapi i samband med förbättrat resultat 11,12.
Traditionella metoder för att detektera antikroppar, såsom enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA) och Western blot har använts för detektion av antikroppar i sera. Men de inte med lätthet kunna erkännas av extracellulära eller yt-epitoper och snarare kan avslöja immunreaktivitet mot en intracellulär epitop. Dessutom kan antikroppar som binder till den extracellulära domänen av viktiga proteiner som är involverade i neurotransmission kommer sannolikt att vara patogent 2,3,7,13,14. Därför är utvecklingen av exakta och känsliga analyser för att upptäcka relevanta cellytan eller extracellulära antikropps mål i patienterna av största vikt. Guldet standardmetod inom området är baserad på användningen av levande celler, i så kallade "cell-based analyser ". Detta förfarande innefattar expression av ett antigen på ytan av däggdjursceller (oftast humana embryonala njur-293 (HEK293)-celler) i sin nativa form genom transfektion av vektorer innehållande den fullständiga cDNA-sekvensen för antigenet av intresse. Levande nonpermeabilized Cellerna inkuberas sedan med utspätt patientserum och följt av fluorokrom-konjugerad anti-human-immunoglobulin (Ig) sekundär antikropp. Intensiteten eller nivån av fluorescens detekteras sedan och är associerad till nivån av autoantikroppsbindning. Denna teknik är specifik, eftersom endast ett antigen överuttrycks i celler. Den mest använda "read-out" har varit konfokalmikroskopi analys efter immunocytokemi 4,5,8-10. Emellertid flödescytometri cellbaserade analyser har med framgång använts för att detektera antikroppar i patienter med demyeliniseringssjukdomar 15-17. Särskilt Waters et al. 15 jämfört påvisande av antikroppar med användning av en pannael av antikroppsdetekteringsmetoder, inklusive cell-baserade analyser, följt av mikroskopi eller flödescytometri analyser, och har visat flödescytometri cellbaserad analys för att vara den mest känsliga, exakt och tillförlitlig metod. Därför är flödescytometri cellbaserad analys fördelaktigt eftersom det är kvantitativ, inte utredare beroende, och innebär inte någon användning av radioaktiva material. Det är också praktiskt eftersom det tillåter stora patientgrupper som skall analyseras på en kort tid.
På senare tid har vi optimerat en hög genomströmning flödescytometri cellbaserad analys för att upptäcka NMDAR antikropp och D2R antikroppar hos patienter med autoimmuna CNS-sjukdomar 11. Vår grupp detekterades nyligen NMDAR antikropp i patientserum med användning av flödescytometri cellbaserad analys. Dessa NMDAR antikroppspositiva sera tidigare analyserades med användning av konfokalmikroskopi och befanns även vara positiv 11. Detta protokoll beskriver en flödescytometri cellbaserad analys för detektion av Conformation känsliga CNS-antikroppar i patientserum som använder en automatiserad hög genomströmning sampler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta dokument beskriver en ny tillämpning av flödescytometri levande cellbaserad analys för att påvisa antikroppar riktade mot specifika cellytan neuronala proteiner med hjälp av en hög genomströmning sampler. Med denna teknik, rapporterar vi att en undergrupp av patienter som drabbats med autoimmuna CNS-sjukdomar har serumantikroppar till ytan NMDAR eller till ytan D2R.
Viktiga steg för optimal detektionsantikropp använder denna hög genomströmning flödescytometri levande cellba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den australiska nationella hälso-och medicinska forskningsrådet, Star Scientific Foundation (Australien), Tourettes syndrom Association (USA), The Trish Multipel skleros Research Foundation och multipel skleros Research Australien, Petre Foundation (Australien), den Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australien). Vi tackar alla de patienter och anhöriga som lämnat prover för vår studie.
Materials
| pIRES2-EGFP vector | Clontech | 6029-1 | |
| Human HA-Dopamine-2 receptor (D2R) cDNA | Missouri S&T cDNA Resource Centre | DRD020TN00 | |
| Human subunit 1 of NMDAR (NR1) cDNA | Gift from Prof A. Vincent (Oxford, UK) | ||
| Monoclonal purified mouse anti-human NR1 antibody (clone: 54.1) | BD Pharmingen | 556308 | |
| Mouse purified monoclonal anti-DRD2 IgG (clone: 1B11) | Sigma-Aldrich | WH0001813M1-50UG | |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse IgG (H + L) | Invitrogen | A31571 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-human IgG (H + L) | Invitrogen | A21445 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (1x) 4.5 g/L D-glucose, L-Glutamine and 110 mg/L sodium pyruvate | Invitrogen | 11995-065 | |
| Foetal bovine serum | Invitrogen | 10099-141 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 15710-072 | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| Geneticin | Invitrogen | 10131-035 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (1x) (-Ca2+/-Mg2+) | Invitrogen | 14190-144 | |
| TrypLE Express (1x) with Phenol Red | Invitrogen | 12605-028 | |
| 0.9% Sodium chloride | Baxter | AHF7975 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 9002-98-6 | |
| Versene | Invitrogen | 15040-066 | |
| XhoI | Roche | 10899194001 | |
| NheI | Roche | 10885843001 | |
| PureLink PCR Purification Kit | Invitrogen | K3100-01 | |
| JetQuick Gel Extraction Spin Kit | Genomed | 420050 | |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10481220001 | |
| Plasmid Plus Maxi Kit | Qiagen | 12963 | |
| Name of Equipment/Software | Company | Catalog Number | Model/Version |
| Flow cytometer with high-throughput sampler system | BD Biosciences | BDLSRII with HTS | |
| Inverted microscope | Olympus | CKX41 (with mercury lamp and U-RFLT50 power supply) | |
| Electronic multichannel pipette (15-300 μl) | Eppendorf | 613-2240P | 12-channel Xplorer Plus |
| Excel | Microsoft | 2010 | |
| Prism | GraphPad Software, Inc. | v4 | |
| FlowJo | Treestar | v7.5 | |
| 50 ml polypropylene conical tubes | BD Biosciences | 352070 | |
| 6-well plate | BD Biosciences | 353046 | |
| Tissue culture flask (T75) | BD Biosciences | 353136 | |
| Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM-992 | |
| V-bottom 96-well plate | Corning | 651180 |
References
- Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins. Neurol. 77, 179-189 (2011).
- Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges. Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).
- Dalmau, J., et al. Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies. Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).
- Dalmau, J., et al. Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma. Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).
- Dale, R. C., et al. N-methyl-D-aspartate receptor antibodies in pediatric dyskinetic encephalitis lethargica. Ann Neurol. 66, 704-709 (2009).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen. Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).
- Lai, M., et al. AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location. Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).
- Irani, S. R., et al. Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia. Brain. 133, 2734-2748 (2010).
- Lai, M., et al. Investigation of LGI1 as the antigen in limbic encephalitis previously attributed to potassium channels: a case series. Lancet Neurol. 9, 776-785 (2010).
- Lancaster, E., et al. Antibodies to metabotropic glutamate receptor 5 in the Ophelia syndrome. Neurol. 77, 1698-1701 (2011).
- Dale, R. C., et al. Antibodies to surface dopamine-2 receptor in autoimmune movement and psychiatric disorders. Brain. , (2012).
- Titulaer, M. J., et al. Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study. Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).
- Hughes, E. G., et al. Cellular and synaptic mechanisms of anti-NMDA receptor encephalitis. J Neurosci. 30, 5866-5875 (2010).
- Bien, C. G., et al. Immunopathology of autoantibody-associated encephalitides: clues for pathogenesis. Brain. 135, 1622-1638 (2012).
- Waters, P. J., et al. Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays. Neurol. 78, 665-671 (2012).
- McLaughlin, K. A., et al. Age-Dependent B Cell Autoimmunity to a Myelin Surface Antigen in Pediatric Multiple Sclerosis. J Immunol. 183, 4067-4076 (2009).
- Probstel, A. K., et al. Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis. Neurol. 77, 580-588 (2011).
- Cho, D., et al. N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes. British journal of pharmacology. , (2011).
- Zhou, D., et al. Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).
- Brilot, F., et al. Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease. Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).
- Boronat, A., et al. Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2. Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).
- Hinson, S. R., et al. Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2. J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).
